Um modelo epitelial de interface ar-líquido para exposição de inalação realista e repetida a partículas aéreas para testes de toxicidade

Summary

Descrito é o método de cultura celular e exposição de um modelo brônquico in vitro para exposição realista e repetida de inalação a partículas para testes de toxicidade.

Abstract

Para testes de toxicidade de partículas transmitidas pelo ar, sistemas de exposição de interface ar-líquido (ALI) foram desenvolvidos para testes in vitro, a fim de imitar condições de exposição realistas. Isso coloca demandas específicas nos modelos de cultura celular. Muitos tipos de células são afetados negativamente pela exposição ao ar (por exemplo, secando) e só permanecem viáveis por alguns dias. Isso limita as condições de exposição que podem ser usadas nesses modelos: geralmente concentrações relativamente altas são aplicadas como uma nuvem (ou seja, gotículas contendo partículas, que se instalam rapidamente) dentro de um curto período de tempo. Tais condições experimentais não refletem exposição realista a longo prazo a baixas concentrações de partículas. Para superar essas limitações o uso de uma linha celular epitelial brônquica humana, calu-3 foi investigado. Essas células podem ser cultivadas em condições de ALI por várias semanas, mantendo uma morfologia saudável e uma monocamada estável com junções apertadas. Além disso, este modelo brônquico é adequado para testar os efeitos de exposições repetidas a baixas concentrações realistas de partículas transmitidas pelo ar usando um sistema de exposição ALI. Este sistema usa um fluxo de ar contínuo em contraste com outros sistemas de exposição ali que usam uma única nebulização produzindo uma nuvem. Portanto, o sistema de fluxo contínuo é adequado para exposição repetida e prolongada a partículas transmitidas pelo ar, monitorando continuamente as características das partículas, concentração de exposição e dose fornecida. Em conjunto, este modelo brônquico, em combinação com o sistema de exposição contínua de fluxo, é capaz de imitar condições realistas e repetidas de exposição à inalação que podem ser usadas para testes de toxicidade.

Introduction

Os pulmões são vulneráveis à exposição à inalação de partículas transmitidas pelo ar. Para avaliar a toxicidade potencial das partículas transportadas pelo ar, foram feitos progressos no desenvolvimento de sistemas de exposição de interface ar-líquido (ALI)^1,2,3,4,5. Os sistemas de exposição ALI permitem modelos de exposição mais relevantes e realistas em comparação com a exposição submersa tradicional via meio cultural que altera as características e cinéticas das partículas⁶. Os sistemas de exposição ali colocam demandas específicas sobre os modelos de cultura celular, pois os modelos carecem de meio de cultura e, portanto, nutrientes no lado apical. Muitos modelos celulares são afetados negativamente por serem cultivados e expostos ao ar (por exemplo, secando) e só permanecem viáveis por alguns dias. Isso limita as condições de exposição que podem ser usadas nesses modelos: geralmente concentrações relativamente altas são aplicadas em um curto período de tempo como uma nuvem (ou seja, gotículas contendo partículas, que se estabelecem rapidamente). Tais condições experimentais não refletem exposição realista a longo prazo a baixas concentrações de partículas; assim, a relevância dos resultados pode ser questionada. Para superar essas limitações, o protocolo de cultura e exposição para um modelo brônquico composto pela linha de células epiteliais brônquicais humanas Calu-3⁷ foi otimizado.

A maioria dos modelos pulmonares in vitro usados para exposição ali contêm outras linhas celulares como A549, BEAS-2B e 16HBE14o- (16HBE) ou células primárias como base⁸. Essas linhas celulares têm a desvantagem de que permanecem viáveis por apenas alguns dias quando cultivadas no ALI. Além disso, algumas dessas linhas de celular superessuem quando cultivadas por um período superior a 5 dias. Finalmente, as células A549 perdem junções funcionais e, portanto, não podem formar uma barreira apertada que é necessária para imitar os pulmões^9,10. Células epiteliais primárias podem ser uma boa opção para a exposição ali, pois podem ser cultivadas no ALI por semanas. No entanto, as células primárias diferem de lote para lote, são mais difíceis de manter, e são mais caras em comparação com linhas celulares, o que as torna menos adequadas para testes de toxicidade e triagem. Ao comparar diferentes linhas de células epiteliais brônquias humanas (16HBE, Calu-3, H292 e BEAS-2B), apenas as células Calu-3 cumprem todos os critérios necessários para exposição realista e repetida da ALI: permanecem viáveis por semanas enquanto cultivadas no ALI, fornecem uma alta barreira de integridade, não superarem demais e são fáceis de cultivar e manter. As células calu-3 são originárias de um adenocarcinoma e são capazes de produzir muco^11,12. Há inconsistências quanto à possibilidade de as células desenvolverem cilia^11,13. As células calu-3 também são um modelo adequado para estudar infecções pelo vírus sincicial respiratório (RSV) que infectam células epiteliais das vias aéreas ciliadas¹⁴.

Além do modelo celular, um sistema de exposição automatizado (AES) é usado para a exposição ar-líquido a aerossóis^15,16. O AES tem a vantagem de usar um fluxo de ar contínuo para expor o modelo celular a aerossóis. Isso contrasta com outros sistemas de exposição ar-líquido que geralmente usam concentrações relativamente altas em um curto período de tempo como uma nuvem (ou seja, gotículas contendo partículas que se instalam rapidamente)^17,18,19. Esses sistemas de nuvem não refletem exposição realista a longo prazo a baixas concentrações de partículas. Aplicando um fluxo de ar contínuo usando o AES, o modelo celular pode ser exposto a uma baixa concentração de partículas durante um período de tempo mais longo, refletindo condições realistas de exposição. Outra vantagem sobre os sistemas de nuvem é que o AES tem a opção de conectar instrumentos de caracterização de partículas, permitindo a medição do tamanho das partículas, concentração de números e massa ao longo do tempo. Uma limitação do AES é que ele usa fluxos de ar relativamente altos entre 10 mL/min e 100 mL/min.

Protocol

1. Preparar o meio de cultura celular (CCM)

1. Prepare uma garrafa de 500 mL de meio essencial mínimo (MEM) complementada com glutamina.
2. Adicione 5 mL de penicilina-estreptomicina (ou seja, penicilina U/mL e 100 μg/mL streptomicina).
3. Adicione 5 mL de solução de aminoácidos não essenciais (NEAA).
4. Adicione 10 mL de anfotericina B (opcional).
5. Adicione 50 mL de FBS (calor inativado, siga o protocolo ATCC para inativação de calor; (https://www.atcc.org/~/media/PDFs/Culture%20Guidas/AnimCellCulture_Guide.ashx, página 19)).

2. Subcultura de células Calu-3

NOTA: As células Calu-3 são cultivadas em frascos de cultura celular T75 ou T175 a 37 °C e 5% de CO₂. As células são passagemdas a 60-80% de confluência a cada 7 dias com renovação do CCM a cada 2-3 dias. CCM é derramado e CCM fresco (T25 = 5 mL, T75 = 15 mL, e T175 = 25 mL) é pipetado no frasco e o frasco é colocado de volta na incubadora. As células devem ser passagemdas pelo menos 2x após o descongelamento, antes de serem utilização em experimentos, ou antes de congelar, e devem ser passagemdas não mais do que 25x no total.

1. Confirme se o frasco é 60-80% confluente verificando sob um microscópio leve.
2. Despeje o CCM do frasco.
3. Lave as células 2x com 5 mL de Solução de Sal Balanceado (HBSS) da Hanks sem cálcio e sem magnésio. Descarte o HBSS após cada lavagem. O HBSS remove o soro, que inibe a trippsina.
4. Adicione 3 mL de trypsin-EDTA para um T75 (4 mL para um T175) e coloque o frasco de volta na incubadora a 37 °C e 5% de CO₂ por 10-15 min. Verifique após 10 minutos, garantindo que as células se desvincularam da superfície do frasco. Caso as células sejam cultivadas para >80% de confluência, elas não se desprenderão usando trippsina 0,05% e trypsin 0,25% poderia ser usada.
5. Adicione 6 mL (ou seja, dobre o volume trypsin-EDTA originalmente adicionado) de CCM ao frasco e balance suavemente os frascos para garantir a mistura adequada. Isto é para garantir que a trippsina tenha sido neutralizada pelo FBS no CCM e sua atividade nas células paradas. Se a trippsina puder manter contato com as células por muito tempo, elas não se recolocarão quando colocadas em um novo frasco de cultura celular.
6. Despeje o conteúdo completo do frasco em um tubo de centrífuga de 50 mL.
7. Centrifugar as células por 5 min a 130 x g,garantindo que a centrífuga esteja corretamente equilibrada.
8. Devolva o frasco contendo as células de volta às condições assépticas e remova o supernatante suavemente, sem perturbar a pelota. O supernasce pode ser derramado e o restante esbofinha, garantindo que a pelota não seja perturbada.
9. Resuspenda a pelota celular em 1 mL de CCM por pipetar para cima e para baixo até que todas as células sejam suspensas (ou seja, não são observadas pelotas ou agglomerados celulares). CcM adicional pode ser adicionado para diluir a suspensão da célula.
10. Conte as células, mortas e vivas, em 1 mL de CCM usando um hemócito. Se necessário para uma contagem adequada, dilui as células em 3 ou 4 mL.
11. Suspenda as células no volume CCM necessário e adicione a suspensão da célula em cada frasco. Para alcançar cerca de 80% de confluência em uma semana, sementes 2 x 10⁶ células em um T75 ou 6 x 10⁶ células em um T175.
12. Balance suavemente o frasco e coloque-o de volta na incubadora a 37 °C e 5% de CO₂.
13. Substitua por CCM fresco a cada 2-3 dias e subcultura quando as células atingirem 60-80% de confluência.

3. Semeando células Calu-3 em pastilhas culturais

NOTA: As pastilhas estão disponíveis com diferentes tamanhos de poros. Pequenos tamanhos de poros (por exemplo, 0,4 μm) têm a vantagem de que as células crescem mais facilmente e podem alcançar uma boa barreira já após 5 dias de cultivo em condições submersas, medida pela Resistência Elétrica Epitelial Trans (TEER). No entanto, quando interessados na translocação de partículas, esses poros são muito pequenos e vão prender as partículas. Portanto, tamanhos maiores de poros (por exemplo, 3 μm) são geralmente escolhidos para testar partículas. Ao usar um tamanho maior dos poros, as células precisam de períodos de tempo mais longos (por exemplo, 7 a 10 dias de cultivo em condições submersas) para obter um bom TEER.

1. Prepare a suspensão celular com concentração conhecida seguindo as etapas 2.1-2.10.
2. Células diluídas a uma concentração de 5 x 10⁵ células/mL em CCM pré-caçada para 6 inserções de poço ou 2,5 x 10⁵ células/mL para 12 inserções de poço.
3. Pegue uma placa de cultura celular com pastilhas e coloque em condições assépticas.
4. Encha o lado basolateral com 2 mL de CCM pré-armado para 6 inserções de poço, ou 1 mL para 12 inserções de poços. Ao adicionar o meio de cultura, tire a inserção usando pinças.
5. Misture cuidadosamente a suspensão da célula por tubulação para cima e para baixo. Pipeta 1,0 mL para 6 inserções de poços e 500 μL para 12 inserções de poços (equivalente a 100.000 células/cm²) na parte superior da membrana na inserção de cultura celular com poros de 0,4 μm. Para 3,0 μm de poros, aumente a densidade celular para 128.000 células/cm².
6. Cubra a placa de cultura celular e incubar a 37 °C e 5% de CO₂.
7. Mude o CCM a cada 2 a 3 dias.
8. Que as células se tornem confluentes por 7 dias sob condições submersas antes de continuar a cultura no ALI.
9. Meça teer.
   1. Tome um Voltohmmeter Epitelial complementado com chopstick electrode set e carregue o sistema de bateria durante a noite.
   2. Desconecte o Voltohmômetro do carregador e conecte o eletrodo de pauzinho.
   3. Limpe o eletrodo com 70% de etanol.
   4. Coloque o eletrodo no CCM colocando o eletrodo mais longo na mídia de cultura externa até que ele toque a parte inferior do prato e coloque o eletrodo mais curto na mídia sem tocar na membrana.
   5. Comece com uma pastilha vazia sem células. Aguarde até que a medição estabilize e anote a resistência em Ohms. Esta medida é a resistência da membrana de inserção sem qualquer célula (ou seja, resistência em branco).
   6. Repita a medição para cada inserção e subtraia a resistência em branco para obter a verdadeira resistência.
   7. Para análise de dados, multiplique os valores de resistência pela área de superfície da inserção em Ω x cm². Para uma inserção de 6 poços, a área de superfície é de 4,67 cm². Assim, se uma resistência de 600 Ohm for medida e o fundo for de 120 Ohm, a resistência é de 480 Ohm, que é então multiplicada pela área de superfície de 4,67 cm² para um total de 2.241,6 Ohm x cm². O TEER deve ser >1.000 Ω x cm² para continuar.
10. Remova o CCM do lado apical das pastilhas.
11. Adicione 2 mL de CCM pré-armado para 6 bem e 1 mL para 12 inserções bem ao lado basolateral do poço (ou seja, sob a inserção de cultura celular). O CCM deve tocar a membrana a partir da parte inferior, mas não vazar na parte superior da inserção.
12. Neste ponto as células são apicamente expostas ao ar, que é referido como cultivo no ALI.
13. Células de cultura no ALI na incubadora a 37 °C e 5% DE CO₂ por 7 dias antes da exposição.
14. Mude o CCM basolateral a cada 2-3 dias. As células podem ser usadas no ALI por 6 semanas.

4. Preparando a configuração de exposição

NOTA: As seções 5-7 descrevem os preparativos para exposição de partículas usando uma estação de exposição automatizada (AES, ver Tabela de Materiais). A configuração para nebulização e caracterização de partículas também é compatível com outros sistemas de exposição ali de outros fabricantes. Como exemplo, a exposição a partículas é descrita abaixo. Esses sistemas também podem ser usados para outras exposições, como sensibilizadores, fumaça de cigarro e escapamento diesel. A Figura 1 mostra o AES e um módulo de exposição. A Figura 2 mostra uma representação esquemática da configuração de exposição, incluindo todos os outros instrumentos.

1. Antes de iniciar uma exposição utilizando o AES, conecte o sistema a vários instrumentos para medir características do aerossol; estes são medidos em um fluxo lateral pouco antes dos aerossóis entrarem no gabinete.
   NOTA: Um divisor de fluxo é usado para conectar o fluxo lateral ao equipamento de caracterização de exposição. Geralmente, são utilizados os seguintes equipamentos: dimensionador de partículas de mobilidade de digitalização (SMPS), dimensionador óptico de partículas (OPS), contador de partículas de condensação (CPC), elemento afilado oscilando microequilípmo (TEOM). As medidas SMPS e OPS são realizadas 1x por hora e utilizam o mesmo tubo do divisor de fluxo. O CPC e o TEOM realizam medição contínua e os dados de ambos estão conectados a um data logger modelo Squirrel 2020. Além disso, a concentração de massa gravimétrica é determinada por meio de um microequilípmo na umidade relativa controlada (40-70%) e condições de temperatura (21-23 °C). Os filtros de teflon são pesados antes e depois de cada exposição para confirmar a concentração de exposição. Para capturar o escapamento, é utilizado um filtro HEPA. A configuração, incluindo suspensões de nanomateriais (ENM) projetadas e nebulizadores são todos colocados em um armário de fluxo para evitar qualquer exposição às pessoas. O AES pode ser usado para testar muitos tipos diferentes de ENMs, incluindo metais e óxidos metálicos.
2. Prepare uma suspensão de nanomateriais pouco antes da exposição. Normalmente, uma suspensão de 1% é preparada como uma solução de estoque. Por exemplo, suspenda 100 mg de nanomaterial por 10 mL de água pura.
   NOTA: Para exposição ao DQ12, 300 mgs são usados para atingir cerca de 2 μg/cm². Esse montante pode ser usado em uma única exposição ou dividido em exposições repetidas (por exemplo, 300 mgs é suspenso em 30 mL para uma única exposição ou 21,5 mgs é suspenso em 2,15 mL fresco todos os dias durante 3 semanas de exposição repetida). A suspensão é preparada recentemente em cada dia de exposição. A suspensão de partículas é sônica por 16 min usando sônica de sonda. O volume da solução de estoque de 1% é ajustado para um volume total de 100 mL adicionando água pura.
3. Coloque a suspensão ENM em uma pequena garrafa com uma tampa e um agitador magnético para evitar a fixação das partículas. Conecte a garrafa a uma bomba peristáltica através de um tubo pequeno e ajuste o fluxo para 25 mL/h.
4. Conecte a bomba peristáltica a um bocal de pulverização e ajuste as configurações para permitir a aerossolização contínua.
5. O bocal de pulverização é montado em um tubo de alumínio de 60 cm de comprimento (câmara de mistura, diâmetro de 15 cm, aquecido a 60 °C). A configuração é conectada ao AES através de um tubo de cobre de 1,5 metros de comprimento (diâmetro de 15 cm). Em cima do AES, um impactor remove todos os aerossóis maiores que 2,5 μm.
6. Conecte o bocal de pulverização a 3 barras de ar comprimido através de dois controladores de fluxo de massa (MFC) para permitir a nebulização das suspensões. Um fluxo de 14 L/min é usado para o bocal de pulverização, o outro MFC para mistura do ar no tubo.
7. Um dia antes do início da exposição, ligue o AES para permitir que o gabinete atinja uma temperatura de 37 °C.
8. Ligue o fluxo de ar e a umidade no gabinete 2h antes do início da exposição, para atingir 85% de umidade. Ligue o aquecimento das câmaras de exposição nas quais as pastilhas com as células serão colocadas.
9. Ligue o microequilípmo de quartzo (QCM) e defina o valor inicial em 0 usando o software. Comece a registrar. A cada 10 s a massa é medida e expressa como ng/cm².
10. Aqueça a mídia da cultura celular a 37 °C em um banho de água (~20-30 min).

5. Preparando células Calu-3 para exposição

NOTA: Para uma exposição típica de ALI usando o AES, são necessárias 15-20 inserções com uma camada celular confluente. Estes consistem em 3 controles de ar limpo, 3 controles de incubadora que serão manuseados de forma semelhante às outras pastilhas sem exposição no AES, 6-8 inserções para exposição aerossol (dependendo do uso de 0, 1 ou 2 microbalancens), 1-3 inserções para medições de controle (como liberação máxima de LDH) e 3 inserções sobresssalentes no caso de o TEER de algumas das pastilhas não for suficiente. As células devem ter um TEER de >1.000 Ω x cm² para continuar.

1. No primeiro dia de exposição, lave as células 1x com CCM, verifique a morfologia celular e meça o TEER do modelo celular usando um Voltohmmeter. As células devem formar uma monocamada apertada sem lacunas.
2. Coloque 2 mL/1 mL de CCM tamponado HEPES sem FCS para o lado basolateral de 6 placas de poço/12 e transfira as pastilhas de cultura com células para as novas placas.
   NOTA: Durante a exposição, nenhum CO₂ está presente no AES. Portanto, o meio de cultura tamponada HEPES (25 mM HEPES) é utilizado durante o transporte e exposição. Este meio é usado tanto para as células expostas no AES como para as células de controle da incubadora.
3. Caso o tempo de transporte das culturas celulares para o AES seja superior a 5 minutos, coloque as células em uma incubadora portátil de 37 °C durante o transporte.

6. Manusear o AES durante uma exposição

1. No AES, preencha os módulos de exposição com CCM tamponado com HEPES sem soro de panturrilha fetal (FCS). A quantidade de CCM depende da unidade utilizada e do tipo de inserção de cultura celular. Tenha em mente que para manter as células no ALI, o meio deve atingir a parte inferior da membrana, mas não deve vazar em cima da membrana. Ao usar 6 inserções de poço, adicione 6 mL de CCM tamponado hepes aos módulos de exposição.
2. Transfira as pastilhas com células das placas para os módulos de exposição usando pinças estéreis. Verifique se não há bolhas de ar no lado basolateral das células e remova qualquer CCM no lado apical das pastilhas. Caso haja algumas bolhas de ar no lado basolateral, gire suavemente as pastilhas usando as pinças estéreis até que sejam removidas. Mantenha as placas contendo CCM em uma incubadora para transferência após uma exposição.
3. Use o visor touchscreen para escolher a duração da exposição, a taxa de fluxo de ar e o aprimoramento da deposição eletrostática. O display também pode ser usado para verificar a umidade e a temperatura. Normalmente, é escolhida uma duração de exposição de 4h, com uma vazão de 50 mL/min nas pastilhas a 37 °C e 85% de umidade.
   NOTA: Os módulos do primeiro nível(Figura 1)são utilizados para exposição limpa do ar; as inserções neste nível são usadas como controles de exposição ao ar limpo. Os outros módulos do segundo e terceiro nível podem ser usados para exposição aerossol, incluindo dois módulos para microequilípeos de cristal de quartzo (QCM) para medir a deposição on-line.
4. O teste de vazamento deve ser realizado antes de iniciar a exposição. O vazamento precisa ser inferior a 5 mL/min. Siga as instruções no visor AES. Quando o teste de vazamento terminar, a exposição pode ser iniciada. Em caso de vazamento, a tubulação deve ser verificada.
5. Ao final da exposição, abra a porta de um módulo AES, abra os módulos de exposição, coloque a cultura celular de volta às placas de cultura celular e transfira as placas para a incubadora portátil.
6. Colete a mídia dos módulos (ou seja, amostras expostas) e das placas (ou seja, controles de incubadora) para análise posterior, como a medição de lactato desidrogenase (LDH).
7. De volta ao laboratório de cultura celular, transfira as pastilhas de cultura celular para placas cheias de CCM padrão fresco. Coloque as placas de cultura celular na incubadora até a próxima exposição ou até a análise.
8. Após o dia final de exposição, coloque as pastilhas na incubadora até o dia seguinte.
9. No dia seguinte à exposição final, adicione CCM ao lado apical para medir o TEER usando um Voltohmmeter. Colete o APICAL e o CCM basolateral separadamente para análise de citocinas.
10. Remova todos os CCM e realize um ensaio de viabilidade celular adicionando, por exemplo, um reagente de proliferação ao lado apical.

7. Limpeza do AES

1. Encha os módulos de exposição com água, espere 1 min e retire a água. Em seguida, encha os módulos com 70% de etanol, deixe por 10 minutos e retire o etanol. Limpe as trombetas de exposição também com 70% de etanol.
2. Pare o controle de umidade de 85%, mas deixe a temperatura do gabinete a 37 °C para o próximo experimento.

Results

Este artigo fornece um método para culminar e expor células epiteliais brônquicais humanas no ALI que imita condições realistas e repetidas de exposição à inalação que podem ser usadas para testes de toxicidade. Características do modelo celular e do sistema de exposição são essenciais para alcançar um modelo realista de exposição à inalação que pode ser usado para exposições repetidas. Os resultados dessas características são mostrados abaixo.

Requisitos e seleção do modelo celular

Ao selecionar um modelo celular adequado, devem ser levadas em conta as seguintes características:

1. O modelo celular deve ser capaz de formar uma monocamada confluente com junções apertadas em funcionamento para imitar a barreira pulmonar.
2. O modelo celular deve apresentar um desempenho ótimo quando exposto repetidamente ao ar condicionado (temperatura e umidade).
3. O modelo celular deve responder a uma exposição.

Este estudo começou com quatro diferentes linhas de células epiteliais brônquias humanas: 16HBE, Calu-3, H292 e BEAS-2B. Estes são todos amplamente utilizados para testes de toxicidade de nanomateriais e produtos químicos. Das quatro linhas celulares, apenas as células Calu-3 cumpriram todos os requisitos acima. As células formaram uma monocamada com junções apertadas(Figura 3)que permaneceu uma barreira estável ao longo do tempo medida pelo TEER, enquanto as outras linhas celulares não formaram uma barreira ou apresentaram uma queda na função de barreira quando cultivadas no ALI(Figura 4). Além disso, H292 e BEAS-2B tendem a crescer demais em múltiplas camadas celulares quando cultivados por um período de tempo mais longo. A cultura tradicional de células submersas e a cultura ALI diferem muito, pois no lado basolateral os nutrientes apenas estavam disponíveis do lado basolateral e as células eram expostas a condições secas no lado apical. Essas condições podem causar estresse aos modelos celulares, o que pode ser observado medindo a viabilidade celular ao longo do tempo. As linhas celulares 16HBE, H292 e BEAS-2B apresentaram um aumento na liberação de LDH quando cultivadas no ALI, enquanto as células Calu-3 apresentaram apenas uma leve liberação de LDH(Figura 5).

Em seguida, foi testada a resposta do modelo Calu-3 às substâncias. Como substância de controle positivo, o LPS foi administrado via nebulização para o lado apical do modelo. A dose depositada foi de 0,25 μg/cm². As células de Calu-3 apresentaram reação à lipopolíase (LPS) por um aumento na liberação de LDH e na liberação do fator de necrose tumoral alfa (TNF-α)(Figura 6).

Finalmente, a monocamada Calu-3 foi exposta a nanomateriais de sílica de quartzo (DQ12) (IOM, Edimburgo). A sílica cristalina pode induzir a silicose e também pode causar tumores pulmonares. Por isso, a Agência Internacional de Pesquisa em Câncer (IARC) classificou a sílica cristalina como um carcinógeno humano do Grupo I²⁰. Acredita-se que o mecanismo de ação da sílica cristalina seja através da indução de inflamação persistente causada por sua superfície reativa^21,22,23. Vários estudos in vivo em ratos e camundongos relatam a indução de inflamações e alterações histopatológicas, incluindo tumores e fibrose, após exposição de inalação à sílica cristalina^{24,25,26,27,28,29}. Esses efeitos são todos observados após exposição repetida e/ou acompanhamento a longo prazo. O modelo Calu-3 foi usado para investigar se as observações dos estudos in vivo poderiam ser imitadas usando um modelo in vitro que poderia ser exposto repetidamente no ALI.

As células Calu-3 foram expostas por 3 semanas consecutivas, 5 dias por semana, 4h por dia ao DQ12. A dose depositada foi medida por meio de um QCM. A dose média depositada foi de 120 ng/cm² por dia, com uma dose cumulativa de 1,6 μg/cm^2,semelhante às doses induzindo um efeito in vivo. Outras características de partículas são mostradas na Tabela 1. Após 3 semanas de exposição, o DQ12 não induziu efeitos significativos na liberação de TEER, viabilidade celular e quimioattractant monocito 1 (MCP-1), em comparação com os controles de ar limpo(Figura 7). Como mais toxicidade do DQ12 era esperada com base nos dados in vivo, a reatividade das partículas foi verificada usando um ensaio acelular de acordo com o protocolo otimizado dentro do projeto DA UE GRACIOUS (entregue 5.3). A reatividade do lote DQ12 foi menor do que o esperado(Figura 8),ordens de magnitudes inferiores em relação às partículas de controle positivos preto carbono (CB). Essa falta de reatividade pode explicar a ausência de uma resposta de toxicidade no modelo Calu-3.

Figura 1: A estação de exposição automatizada (AES).
A figura esquerda mostra o lado de fora do armário com o painel de toque. O AES possui três níveis com módulos de exposição: o nível superior para exposições de ar limpo e o nível médio e inferior para exposições aerossóis. A figura certa mostra o módulo de exposição no qual as pastilhas com células são colocadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Representação esquemática da configuração de exposição.
Da esquerda para a direita: 1) a suspensão ENM conectada ao bocal de pulverização através de uma bomba peristáltica; 2) Utilizando ar comprimido o bocal de spray nebuliza a suspensão ENM e através de uma câmara de mistura os aerossóis são levados para o AES; 3) Pouco antes de entrar no AES, os instrumentos de caracterização aerossol estão conectados: SMPS, OPS, CPC e TEOM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Imagem representativa das células Calu-3 após a colheita na interface ar-líquido (ALI) por 10 dias.
Imagem de microscopia de fluorescência de células Calu-3 depois de culminar no ALI por 10 dias. Proteína de junção apertada ZO-1 está manchada de verde, núcleos das células estão manchados em azul. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Resistência elétrica transeptelial (TEER) de quatro linhas celulares diferentes durante um período de cultura de 21 dias.
Valores TEER de 16HBE, Calu-3, H292 e BEAS-2B quando cultivados por 21 dias: primeiros 7 dias submersos, seguidos por 14 dias no ALI. Os valores teer foram corrigidos para a resistência de fundo da pastilha e multiplicados pela área superficial da pastilha. Os símbolos e barras de erro representam o valor médio e o desvio padrão de seis inserções. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Liberação LDH de quatro linhas celulares diferentes durante um período de cultura de 21 dias.
Versão LDH de 16HBE, Calu-3, H292 e BEAS-2B quando cultivada por 21 dias: 7 dias submersa, seguida por 14 dias no ALI. Os valores LDH mostrados são relativos à liberação máxima de LDH por tipo de célula. Os símbolos e barras de erro representam o valor médio e o desvio padrão de cinco inserções. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Efeitos celulares em células Calu-3 expostas a LPS.
As células calu-3 foram expostas via nebulização de nuvens a 0,25 μg/cm² LPS. (A) A conversão WST-1. (B) Liberação LDH. (C) TNF-α lançamento após a exposição lps. Os símbolos e barras de erro representam valores médios e desvios padrão de três inserções. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Efeitos celulares em células Calu-3 expostas a nanomateriais DQ12.
As células calu-3 foram expostas por 3 semanas (4h por dia, 5 dias por semana) a nanomateriais DQ12, cerca de 120 ng/cm² por dia, dose acumulada de 1,6 μg/cm². (A) Valores TEER. (B) Liberação LDH. (C) Liberação do MCP-1 após a exposição ao DQ12. Todos os símbolos e barras de erro representam valores médios e desvios padrão de três inserções para os controles e seis inserções para a exposição dQ12. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8: Reatividade Acelular do DQ12.
O DQ12 foi incubado com uma sonda diacetato de 20,70-Dicclorofluorescein (DCFH-DA) para detectar sua reatividade superficial. Como controle positivo, foram incluídas partículas pretas de carbono (CB). Comparado ao CB, o DQ12 tem reatividade superficial muito baixa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Massa de partículas (μg/m3)	Número de partículas (#/cm3)	Tamanho da partícula de mobilidade (nm)	Desvio padrão geométrico	Tamanho de partícula óptica (μm)
2969 (418)	83983 (10215)	66.6	2.5	1.1 (1.3)

Tabela 1: Características de exposição do DQ12. Os valores são mostrados como médios com desvio padrão entre parênteses.

Discussion

Este artigo descreve um método para a cultura de células epiteliais brônquias humanas sob ALI e expor este modelo brônquico a aerossóis ou gases. A vantagem de usar células Calu-3 é que elas formam junções apertadas, permanecem uma monocamada, são capazes de suportar o fluxo de ar, e podem ser cultivadas por semanas no ALI, ao contrário de muitos outros tipos de células (por exemplo, 16HBE, H292 e BEAS-2B). O uso da estação^de exposição automatizada ® VITROCELL (AES) tem a vantagem de que as células podem ser expostas em condições realistas e relevantes, pois baixas concentrações podem ser aplicadas usando um fluxo de ar contínuo.

Sistemas de fluxo contínuo, como o AES, têm vantagens em relação ao uso de sistemas de nuvem^3,32, que utilizam uma única nebulização de uma suspensão. O fluxo contínuo é mais realista e muitas variáveis como vazão, umidade e temperatura são controladas. Além disso, a deposição pode ser aprimorada usando um campo elétrico. Finalmente, características do aerossol como tamanho, concentração de números e massa são monitoradas on-line. Uma desvantagem é que os sistemas de fluxo contínuo são mais complexos em comparação com os sistemas de nuvem. Por isso, é importante realizar experimentos preparatórios que se concentrem nas características de partículas do aerossol e na dose entregue na inserção. A concentração inicial das partículas e das configurações do AES pode então ser ajustada para alcançar a dose desejada nas células³³. Dependendo do tipo de partículas que estão sendo testadas, o método de geração de aerossol pode diferir. O uso de deposição eletrostática depende do tipo de partícula e funciona melhor para partículas metálicas. Para partículas com uma superfície positiva carga um campo eletrostático negativo deve ser aplicado e vice-versa.

A seleção de concentrações de exposição pode ser difícil para qualquer experimento de exposição ar-líquido. Para as exposições do DQ12, o objetivo foi alcançar uma dose acumulada total de 1 μg/cm² após 3 semanas de exposição, 5 dias por semana, 4h por dia. Esta dose é semelhante às doses que induziram um efeito in vivo^{21,25,27,32,33}. Ao realizar as exposições, houve alguma variação entre diferentes dias de exposição. Embora a dose real depositada de 1,6 μg/cm² seja maior do que a 1 μg/cm² que foi destinada, a dose pode ter sido muito baixa para observar efeitos no modelo Calu-3. Apenas pequenas diferenças no TEER, viabilidade e resposta à citocina foram observadas entre a exposição ao ar limpo e a exposição ao DQ12, e essas diferenças não foram estatisticamente significativas. Uma explicação para a observação de que a exposição ao DQ12 durante 3 semanas não induziu efeitos significativos nas células calu-3 é que os macrófagos estavam faltando do modelo Calu-3. Possivelmente, após a absorção do DQ12, macrófagos produzem citocinas proinflamatórias que podem afetar as células de Calu-3. Outra explicação é que o lote DQ12 que foi utilizado para os experimentos não foi tão reativo quanto o esperado. Ao usar o LPS como uma substância de controle positiva, o Calu-3 mostra uma resposta, medida por um aumento na liberação de LDH e um aumento na liberação de α TNF. Isso indica que o modelo pode detectar toxicidade.

O modelo de células Calu-3 tem muitas vantagens, como discutido na seção de resultados. Além disso, quando cultivadas por mais tempo no ALI, as células Calu-3 podem cultivar estruturas semelhantes a cílios¹³ e produzir muco^11,12,13. Apesar dessas vantagens, o modelo tem limitações em relação à sua relevância fisiológica. As linhas celulares Calu-3 são originárias de um adenocarcinoma, enquanto 16HBE e BEAS-2B são originárias de tecido saudável. Infelizmente, os dois últimos não são adequados para a exposição repetida da ALI, pois não permanecem uma monoposta estável ao longo do tempo. Outra limitação do modelo Calu-3 é que ele representa apenas um único tipo de célula. No pulmão humano, vários tipos de células que interagem e respondem de forma diferente à exposição estão presentes. Partículas inaladas serão depositadas em diferentes regiões dos pulmões, dependendo do tamanho aerodinâmico. É aqui que as partículas entram em contato com a barreira celular epitelial, como imitado pelo modelo Calu-3. No pulmão humano, macrófagos alveolares são atraídos pelas partículas, engolfam-nas e as limpam dos pulmões. Os macrófagos também desempenham um papel essencial na resposta à inflamação à exposição de partículas. Portanto, esforços estão sendo feitos para estender o modelo Calu-3 adicionando macrófagos primários para imitar a barreira pulmonar mais de perto. A desvantagem dos macrófagos é que eles permanecem viáveis apenas por cerca de 7 dias quando cultivados em cima de células Calu-3 no ALI. Portanto, os macrófagos devem ser reassumatados semanalmente para transformar o modelo Calu-3 atual em um modelo de cocultura. A otimização do protocolo de cocultura está em andamento.

Dado o exposto acima, o modelo brônquico Calu-3 é um modelo adequado para exposição repetida a aerossóis de substâncias parcialmente solúveis, como produtos químicos provenientes de fumaça de cigarro e LPS. Estas substâncias solúveis induzem aumentos significativos nas respostas de citocinas nas células de Calu-3. Para testar partículas insolúveis, como o escapamento diesel e o DQ12, é necessário um modelo de cocultura, pois os macrófagos desempenham um papel crucial na indução de efeitos por exposição a partículas.

Para as exposições descritas, foram utilizadas membranas de inserção com poros de 3,0 μm. A principal razão para escolher esse tipo de inserção é que é possível testar a translocação de nanomateriais. Ao usar tamanho de poros menor de 0,4 μm, os aglomerados de partículas não serão capazes de atravessar a membrana de inserção. A desvantagem de usar um grande tamanho de poros é que as células precisam de um tempo maior para crescer confluentes e que é mais difícil visualizar a morfologia das células usando microscopia leve. Para verificar se as células formam uma monocamada confluente, o TEER deve ser >1.000 Ω x cm² antes de iniciar uma exposição.

Em conjunto, o modelo brônquico Calu-3 apresentado aqui é adequado para uso para exposição repetida a aerossóis, pelo menos até 3 semanas. O modelo pode suportar ser cultivado e exposto através de um fluxo de ar contínuo e é capaz de detectar toxicidade ao epitélio brônquico.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,01 M NaOH	Sigma Aldrich	S5881
0,1M (x10) PBS	Gibco	14200-059
2',7'-diclorodihidrofluoresina diacetato (DCFH2-DA)	Sigma Aldrich	D6883
(cloridrato de SIN-1)	Abcam	ab141525
Anfotericina B	Thermo Fisher Scientific Inc.	15290
Estação de exposição automatizada	Vitrocell
Reagente de proliferação celular WST-1	Roche	11644807001
Centrifuge	Eppendorf
CPC	TSI inc., St Paul MN, USA	3022
Kit de detecção de citotoxicidade LDH	Roche	11644793001
DQ12	IOM		nanomateriais
ELISA Ready-SET-Go	Fischer Scientific	88-8086-86, 88-7399-88
EVOM2	World Precision Instruments Inc., FL, EUA	EVOM2-STX2
FBS	Greiner bio-one	758093
Divisor de fluxo	TSI inc., St Paul MN, EUA	modelo 3708
Diacetato de fluoresceína (F-DA)	Sigma Aldrich	F7378
HBSS	Thermo Fisher Scientific Inc.	14175
Microscópio óptico	Olympus	CKX41
Controladores de fluxo de massa	MFC, Bronkhorst, Holanda
Metanol (grau analítico)	Sigma Aldrich	34860
Microbalance	Sartorius, Goettingen, Alemanha	ME-5
Meio essencial mínimo (MEM) + GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific Inc.	41090
NEAA	Thermo Fisher Scientific Inc.	11140
OPS	TSI inc., St Paul MN, EUA	3339
Pen/Strep	Thermo Fisher Scientific Inc.	15140
Fenol vermelho livre MEM	Gibco	10500-064
Água pura	Merck	MilliQ
SMPS	TSI inc., St Paul MN, EUA	3936
Bico de pulverização	Schlick, Coburg, Alemanha
Filtros de teflon	Pall	R2PJ46
TEOM	Rupprecht & Patashnick NY, EUA	série 1400
Balão de cultura de tecidos	Thermo Fisher Scientific Inc.	690175, 658175, 660175
Transwell inserções	Corning	3460, 3462
Tripsina-EDTA	Thermo Fisher Scientific Inc.	25300
Tryptan Blue	Sigma Aldrich	T8154