Dette papir rapporterer, at tilsætningen af Y-27632 til TIVA medium kan øge udbyttet af melanocytter fra voksne hudvæv.
Isolering og kultur af primære melanocytter fra hudvæv er meget vigtigt for biologisk forskning og har været meget udbredt til kliniske anvendelser. Isoler primære melanocytter fra hudvæv ved den konventionelle metode tager normalt omkring 3 til 4 uger at passage tilstrækkeligt. Endnu vigtigere, det anvendte væv er normalt nyfødte forskind og det er stadig en udfordring at effektivt isolere primære melanocytter fra voksne væv. Vi har for nylig udviklet en ny isolationsmetode for melanocytter, der tilføjer Y-27632, en Rho kinase hæmmer, til den oprindelige kultur medium for 48 h. Sammenlignet med den konventionelle protokol, denne nye metode dramatisk øger udbyttet af melanocytter og forkorter den tid, der kræves for at isolere melanocytter fra forhud væv. Vi beskriver nu denne nye metode mere detaljeret ved hjælp af voksen epidermis til effektivt at dyrke primære melanocytter. Vigtigere er det, vi viser, at melanocytter fremstillet af voksne væv fremstillet ved denne nye metode kan fungere normalt. Denne nye protokol vil i væsentlig grad gavne undersøgelser af pigmenteringsdefekter og melanomer ved hjælp af primære melanocytter fremstillet af let tilgængelige voksne hudvæv.
Målet med denne undersøgelse var at udvikle en enkel og effektiv protokol til at isolere melanocytter fra epidermis af voksen hud til biologisk forskning og kliniske anvendelser. Melanocytter, som er placeret i den basale epidermis af huden og i hårsækkene, spiller en vigtig rolle i pigmentering af hud og hår ved at producere melanin1. Den resulterende hudpigmentering fra epidermale melanocytter fungerer som et ultraviolet strålingsfilter, der reducerer/forhindrer DNA-skader på underliggende celler i huden2. Den unormale spredning af melanocytter i huden er ret almindelig, såsom i dannelsen af godartede nevi (modermærker), hvor melanocytter potentielt omdanne til onkogen vækst efterfulgt af cellulære senescence3.
Siden 1957 har isolation og efterfølgende kultur af menneskelige primære melanocytter været muligt4, men først siden 1982 har der været en effektiv metode, der reproducerbart kan etablere kulturer af menneskelige melanocytter fra epidermis5. Den konventionelle metode til at isolere primære melanocytter fra epidermis indebærer en to-trins enzymatisk fordøjelse. Kort, huden er i første omgang fordøjet med dispase at adskille epidermis fra dermis, hvorefter epidermis er fordøjet med trypsin at producere suspensioner, der indeholder melanocytter og keratinocytter, som derefter kan selektivt dyrkes i forskellige medier. I øjeblikket tager den oprindelige kultur normalt omkring 3 til 4 uger for melanocytter at nå sammenløbet ved hjælp af den konventionelle metode, hvilket sandsynligvis skyldes den lave effektivitet af deres isolation. Derfor ville en forøgelse af den oprindelige produktion af melanocytter fra voksent hudvæv være ganske nyttigt for både laboratorieforskning og kliniske anvendelser.
Mange vækstfaktorer, hvoraf de fleste har vist sig at blive udskædt af keratinocytter (f.eks. α-MSH, ACTH, bFGF, NGF, ET-1, GM-CSF, HGF, LIF og SCF)5-8–8, regulerer differentiering og spredning af pattedyrsmelanocytter. I mangel af feeder lag, manglen på disse vækstfaktorer fører til nedsat spredning af melanocytter og deres øgede apoptose9. Co-kultur keratinocytter som feeder celler og melanocytter kunne føre til accelereret melanocyt spredning og reduceret apoptose. Men co-kultur metode ikke kun kræver mere hudvæv til at forberede keratinocytter, hvilket ikke er praktisk, men også kunne ikke arbejde effektivt, fordi de kulturbetingelser, der kræves af melanocytter ikke favoriserer keratinocyt vækst, og vice-versa.
Tidligere undersøgelser har rapporteret, at tilsætning af Y-27632, en ROCK-hæmmer, i vækstmediet kan øge udbyttet af menneskelige primære epidermale celler fra hudvæv10–14. Derfor ville det være interessant at teste, om isolering af menneskelige primære melanocytter ville drage fordel af tilstedeværelsen af Y-27632. Tilføjelsen af Y-27632 til inokulering TIVA medium15, som indeholder TPA, IBMX, Na3VO4 og dbcAMP, øgede faktisk udbyttet af primære melanocytter isoleret fra forhudvæv i de oprindelige kulturer16. Sammenlignet med den konventionelle protokol, denne nye protokol er betydeligt mere effektiv til at øge udbyttet af melanocytter16. Derfor beskriver denne protokol den nye metode i detaljer ved hjælp af voksen hudvæv baseret på en tidligere undersøgelse16 for at fremme dens anvendelse i grundlæggende og anvendt biologisk forskning.
Den protokol, der er beskrevet her , var baseret på en nylig publikation16. Der bør lægges vægt på følgende kritiske trin for at opnå de bedste resultater med den nye metode. For det første, vellykket adskillelse af epidermis og dermis er afgørende. Skær den voksne forhud væv i 3-4 mm brede strimler ved hjælp af en skalpel klinge for at gøre dispase arbejde mere grundigt og nemt at adskille epidermis fra dermis. For det andet, når de adskiller disse to lag, forurening af dermis bør …
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af The National Key Research and Development Program of China (2017YFA0104604), The General Program of National Natural Science Foundation of China (81772093), Military Logistics Research Project (AWS17J005), Key Program of Shandong Province Natural Science Foundation (ZR2019ZD36) og Key Research and Development Program i Shandong-provinsen (2019GSF108107) til X.W. Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (2019A1515110833) og The Fundamental Research Funds of Shandong University (2019GN043) til J.M.
Alexa fluor-594 donkey anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | A21203 | For Immunofluorescence |
Alexa fluor-594 donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | R37119 | For Immunofluorescence |
Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
15 mL Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
50 mL Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubating |
Constant Temperature Shaker | Shanghai Boxun | 150036 | For water bath |
DAPI | Abcam | ab104139 | For Immunofluorescence |
Dispase | Gibco | 17105-041 | For melanocyte isolation |
DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
Fluorescence microscope | Olympus | 5E44316 | For Immunofluorescence |
Forskolin | MCE | HY-15371 | Induce pigmentation |
Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | melanocyte culture medium |
Ham's F12 | Thermo Scientific | 11330032 | melanocyte culture medium |
Inverted microscope | Olympus | 5C42258 | For cell microscopic observation |
3-isobutyl-1-methyl xanthine (IBMX) | Sigma | 17018 | melanocyte culture medium |
mouse anti-human MITF | Abcam | ab12039 | For Immunofluorescence |
Na3VO4 | Sigma | S6508 | melanocytes culture medium |
N6,2'-O-dibutyryladeno-sine 3',5'-cyclic monophosphate (dbcAMP) | Sigma | D0627 | melanocyte culture medium |
12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (TPA) | Sigma | 79346 | melanocyte culture medium |
Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
rabbit anti-human Ki-67 | Abcam | ab15580 | For Immunofluorescence |
Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifugation |
TC20TM automated cell counter | Bio-Rad | 1450102 | Automatic cell counting |
0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For melanocyte dissociation |
Y-27632 | Sigma | Y0503 | For melanocyte isolation |