נייר זה מדווח כי התוספת של Y-27632 כדי בינונית הגוף יכול להגדיל באופן משמעותי את התשואה של מלנוציטים מרקמות העור למבוגרים.
הבידוד והתרבות של מלנוציטים הראשי מרקמות העור הוא מאוד חשוב עבור מחקר ביולוגי השתמשו באופן נרחב עבור יישומים קליניים. בידוד מלנוציטים הראשי מרקמות העור על ידי השיטה המקובלת בדרך כלל לוקח כ 3 עד 4 שבועות למעבר מספיק. חשוב יותר, הרקמות המשמשות בדרך כלל היילוד עורלות וזה עדיין אתגר כדי לבודד ביעילות מלנוציטים הראשי מרקמות למבוגרים. פיתחנו לאחרונה שיטת בידוד חדשה עבור מלנוציטים המוסיפה Y-27632, מעכבי Rho קינאז, למדיום התרבות הראשונית עבור 48 h. לעומת הפרוטוקול המקובל, זו שיטה חדשה מגדילה באופן דרמטי את התשואה של מלנוציטים ומקצרת את הזמן הנדרש כדי לבודד מלנוציטים מרקמות העורלה. עכשיו אנחנו מתארים את השיטה החדשה הזאת בפירוט רב יותר באמצעות אפידרמיס למבוגרים לתרבות ביעילות מלנוציטים הראשי. חשוב מכך, אנו מראים כי מלנוציטים שהתקבלו מרקמות למבוגרים שהוכנו על ידי שיטה חדשה זו יכולה לתפקד כרגיל. פרוטוקול חדש זה יועיל באופן משמעותי למחקרים של פגמים פיגמנטציה ומלנומה באמצעות מלנוציטים הראשי מוכן בקלות לגשת רקמות עור למבוגרים.
המטרה של מחקר זה היה לפתח פרוטוקול פשוט ואפקטיבי כדי לבודד מלנוציטים מן האפידרמיס של העור המבוגר למחקר ביולוגי ויישומים קליניים. מלנוציטים, אשר ממוקמים באפידרמיס הבזליים של העור ובזקיקי השיער, לשחק תפקיד חשוב בפיגמנטציה של העור והשיער על ידי הפקת מלנין1. העור שנוצר פיגמנטציה מתוך מלנומה באפידרמיס מעשים כמו מסנן קרינה אולטרה סגולה המפחית/מונע נזק DNA לתאים הבסיסיים בעור2. התפשטות חריגה של מלנוציטים בעור הוא די נפוץ, כמו בהיווצרות nevi שפיר (שומות) שבו מלנוציטים בפוטנציאל להפוך לצמיחה אונגניים ואחריו הזדקנות הסלולר3.
מאז 1957, הבידוד והתרבות הבאה של מלנוציטים הראשי האנושי היה אפשרי4, אבל רק מאז 1982 יש כבר שיטה יעילה שיכולה ליצור תרבויות של מלנוציטים אנושייםמתוךהאפידרמיס 5. השיטה המקובלת לבודד מלנוציטים הראשי מתוך האפידרמיס כרוכה בעיכול שני שלבים אנזימטיות. בקצרה, העור מתעכל בתחילה עם בעיות כדי להפריד את האפידרמיס מן dermis, לאחר שאפידרמיס מתעכל עם טריפסין לייצר השעיות המכילות מלנוציטים ו keratinocytes, אשר יכול להיות באופן סלקטיבי גדל במדיה שונים. כיום, התרבות הראשונית אורכת בדרך כלל 3 עד 4 שבועות עבור מלנוציטים כדי להגיע לשטף באמצעות השיטה המקובלת, אשר צפוי בשל היעילות הנמוכה של הבידוד שלהם. לכן, הגדלת הייצור הראשוני של מלנוציטים מרקמות העור למבוגרים יהיה מועיל למדי עבור שני מחקר מעבדה ויישומים קליניים.
גורמי גדילה רבים, שרובם הוכחו להיות מופרש על ידי keratinocytes (למשל, α-msh, acth, bfgf, ngf, ET-1, GM-שדרתי, hgf, אבל scf)5–8, להסדיר את הבידול והתפשטות של מלנוציטים היונקים. בהיעדר שכבות ממזין, חוסר גורמי גדילה אלה מוביל את התפשטות ירידה של מלנוציטים ואפופטוזיס מוגברת שלהם9. שיתוף התרבות של keratinocytes כמו תאים מאכיל ומלנוציטים עלול להוביל להאצת מלנוציט התפשטות ואפופטוזיס מופחת. עם זאת, שיטת שיתוף התרבות לא רק דורש רקמות העור יותר כדי להכין keratinocytes, אשר אינו מעשי, אבל גם לא יכול לעבוד ביעילות כי תנאי התרבות הנדרשים על ידי מלנוציטים אינו מעדיף צמיחה keratinocytes, ולהיפך.
מחקרים קודמים דיווחו כי תוספת של Y-27632, מעכב סלע, לתוך המדיום צמיחה יכול לשפר את התשואה של התאים האנושיים באפידרמיס העיקרי מרקמות העור10–14. לכן, זה יהיה מעניין לבדוק אם הבידוד של המלנוציטים הראשי האנושי יועיל מנוכחותם של Y-27632. אכן, תוספת של Y-27632 לתוך בינונית החיסון15, אשר מכיל הסברתי, Ibmx, Na3VO4 ו dbcamp, הגדילה באופן משמעותי את התשואה של מלנוציטים הראשי מבודד רקמות העורלה בתרבויות הראשוניות16. בהשוואה לפרוטוקול המקובל, פרוטוקול חדש זה הוא יעיל יותר באופן משמעותי בהגדלת התשואה של מלנוציטים16. לפיכך, פרוטוקול זה מתאר את השיטה החדשה בפירוט באמצעות רקמות עור למבוגרים המבוססות על מחקר קודם16 על מנת לקדם את יישומו במחקר ביולוגי בסיסי ומיושם.
הפרוטוקול המתואר כאן התבסס על פרסום16שנערך לאחרונה. יש לשלם תשומת לב מסוימת לשלבים הקריטיים הבאים כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר בשיטה החדשה. ראשית, הפרדה מוצלחת של האפידרמיס והדרמיס היא חיונית. חותכים את הרקמות העורלה למבוגרים לתוך 3-4 mm רצועות רחב באמצעות להב אזמל כדי להפו…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכת על ידי תוכנית המחקר ופיתוח המפתח הלאומי של סין (2017YFA0104604), התוכנית הכללית של הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (81772093), פרויקט מחקר לוגיסטיקה צבאית (AWS17J005), התוכנית המפתח של מחוז שאנדונג המדע הטבעי הקרן (ZR2019ZD36) ואת מחקר מפתח תוכנית פיתוח של מחוז שאנדונג (2019GSF108107) כדי X.W. גואנג-דונג בסיסי מחקר היסוד (2019A1515110833) ואת קרנות המחקר הבסיסי של אוניברסיטת שאנדונג (2019GN043) ל J.M.
Alexa fluor-594 donkey anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | A21203 | For Immunofluorescence |
Alexa fluor-594 donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | R37119 | For Immunofluorescence |
Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
15 mL Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
50 mL Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubating |
Constant Temperature Shaker | Shanghai Boxun | 150036 | For water bath |
DAPI | Abcam | ab104139 | For Immunofluorescence |
Dispase | Gibco | 17105-041 | For melanocyte isolation |
DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
Fluorescence microscope | Olympus | 5E44316 | For Immunofluorescence |
Forskolin | MCE | HY-15371 | Induce pigmentation |
Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | melanocyte culture medium |
Ham's F12 | Thermo Scientific | 11330032 | melanocyte culture medium |
Inverted microscope | Olympus | 5C42258 | For cell microscopic observation |
3-isobutyl-1-methyl xanthine (IBMX) | Sigma | 17018 | melanocyte culture medium |
mouse anti-human MITF | Abcam | ab12039 | For Immunofluorescence |
Na3VO4 | Sigma | S6508 | melanocytes culture medium |
N6,2'-O-dibutyryladeno-sine 3',5'-cyclic monophosphate (dbcAMP) | Sigma | D0627 | melanocyte culture medium |
12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (TPA) | Sigma | 79346 | melanocyte culture medium |
Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
rabbit anti-human Ki-67 | Abcam | ab15580 | For Immunofluorescence |
Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifugation |
TC20TM automated cell counter | Bio-Rad | 1450102 | Automatic cell counting |
0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For melanocyte dissociation |
Y-27632 | Sigma | Y0503 | For melanocyte isolation |