वाई-27632 वयस्क त्वचा ऊतकों से मानव मेलानोसाइट्स की उपज को समृद्ध करता है
Summary
इस पत्र में बताया गया है कि टीवीए माध्यम में वाई-27632 के अलावा वयस्क त्वचा ऊतकों से मेलानोसाइट्स की उपज में काफी वृद्धि हो सकती है।
Abstract
अलगाव और त्वचा के ऊतकों से प्राथमिक मेलानोसाइट्स की संस्कृति जैविक अनुसंधान के लिए बहुत महत्वपूर्ण है और व्यापक रूप से नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया गया है। पारंपरिक विधि द्वारा त्वचा के ऊतकों से प्राथमिक मेलानोसाइट्स को अलग करने में आमतौर पर पर्याप्त रूप से पारित होने में लगभग 3 से 4 सप्ताह लगते हैं। इससे भी महत्वपूर्ण बात, उपयोग किए जाने वाले ऊतक आमतौर पर नवजात पूर्वेखाल होते हैं और वयस्क ऊतकों से प्राथमिक मेलानोसाइट्स को कुशलतापूर्वक अलग करना अभी भी एक चुनौती है। हमने हाल ही में मेलानोसाइट्स के लिए एक नई अलगाव विधि विकसित की है जो पारंपरिक प्रोटोकॉल की तुलना में 48 एच के लिए प्रारंभिक संस्कृति माध्यम में वाई-27632, एक रो किनेज़ अवरोधक जोड़ती है, यह नई विधि नाटकीय रूप से मेलानोसाइट्स की उपज को बढ़ाती है और फोरस्किन ऊतकों से मेलानोसाइट्स को अलग करने के लिए आवश्यक समय को कम करती है। अब हम प्राथमिक मेलानोसाइट्स को कुशलतापूर्वक संस्कृति के लिए वयस्क एपिडर्मिस का उपयोग करके इस नई विधि का वर्णन करते हैं। महत्वपूर्ण बात, हम बताते हैं कि इस नई विधि द्वारा तैयार वयस्क ऊतकों से प्राप्त मेलानोसाइट्स सामान्य रूप से कार्य कर सकते हैं। इस नए प्रोटोकॉल से आसानी से एक्सेस किए गए वयस्क त्वचा ऊतकों से तैयार प्राथमिक मेलानोसाइट्स का उपयोग करके पिगमेंटेशन दोषों और मेलानोमा के अध्ययनों को काफी लाभ होगा।
Introduction
इस अध्ययन का लक्ष्य जैविक अनुसंधान और नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए वयस्क त्वचा के एपिडर्मिस से मेलानोसाइट्स को अलग करने के लिए एक सरल और प्रभावी प्रोटोकॉल विकसित करना था। मेलानोसाइट्स, जो त्वचा के बेसल एपिडर्मिस और बालों के रोम में स्थित हैं, मेलेनिन1का उत्पादन करके त्वचा और बालों के पिगमेंटेशन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। एपिडर्मल मेलानोसाइट्स से परिणामस्वरूप त्वचा का पिगमेंटेशन एक पराबैंगनी विकिरण फिल्टर के रूप में कार्य करता है जो त्वचा में अंतर्निहित कोशिकाओं को डीएनए क्षति को कम/रोकता है2। त्वचा में मेलानोसाइट्स का असामान्य प्रसार काफी आम है, जैसे सौम्य नेवी (मॉल) के गठन में, जिसमें मेलानोसाइट्स संभावित रूप से ऑन्कोजेनिक विकास में बदल जाते हैं जिसके बाद सेलुलर सेनेसेंस3होता है।
1957 के बाद से, मानव प्राथमिक मेलानोसाइट्स का अलगाव और बाद की संस्कृति4संभव हो गई है, लेकिन 1982 के बाद से ही एक कुशल तरीका रहा है जो एपिडर्मिस5से मानव मेलानोसाइट्स की संस्कृतियों को पुन: स्थापित कर सकता है। एपिडर्मिस से प्राथमिक मेलानोसाइट्स को अलग करने की पारंपरिक विधि में दो-चरण एंजाइमेटिक पाचन शामिल है। संक्षेप में, त्वचा को शुरू में डर्मिस से एपिडर्मिस को अलग करने के लिए डिस्पास के साथ पचाया जाता है, जिसके बाद एपिडर्मिस को मेलानोसाइट्स और केराटिनोसाइट्स युक्त निलंबन का उत्पादन करने के लिए ट्रिप्सिन के साथ पचाया जाता है, जिसे फिर चुनिंदा मीडिया में उगाया जा सकता है। वर्तमान में, प्रारंभिक संस्कृति आमतौर पर पारंपरिक विधि का उपयोग करके मेलानोसाइट्स तक पहुंचने में लगभग 3 से 4 सप्ताह लगती है, जो उनके अलगाव की कम दक्षता के कारण होने की संभावना है। इसलिए, वयस्क त्वचा ऊतकों से मेलानोसाइट्स के प्रारंभिक उत्पादन में वृद्धि प्रयोगशाला अनुसंधान और नैदानिक अनुप्रयोगों दोनों के लिए काफी मददगार होगी।
कई विकास कारक, जिनमें से अधिकांश को केराटिनोसाइट्स (उदाहरण के लिए, α-MSH, ACTH, bFGF, NGF, ET-1, GM-CSF, HGF, LIF और एससीएफ)5-8–8द्वारा स्रावित दिखाया गया है, जो स्तनधारी मेलानोसाइट्स के भेदभाव और प्रसार को विनियमित करता है। फीडर परतों के अभाव में, उन विकास कारकों की कमी से मेलानोसाइट्स का प्रसार कम हो जाता है और उनके बढ़े हुए एपोप्टोसिस9। फीडर कोशिकाओं और मेलानोसाइट्स के रूप में केराटिनोसाइट्स की सह-संस्कृति त्वरित मेलानोसाइट प्रसार और कम एपोप्टोसिस का कारण बन सकती है। हालांकि, सह-संस्कृति विधि न केवल केराटिनोसाइट्स तैयार करने के लिए अधिक त्वचा ऊतकों की मांग करती है, जो व्यावहारिक नहीं है, बल्कि कुशलता से काम नहीं कर सकती है क्योंकि मेलानोसाइट्स द्वारा आवश्यक संस्कृति की स्थिति केराटिनोसिटे विकास के पक्ष में नहीं है, और इसके विपरीत।
पिछले अध्ययनों से पता चला है कि विकास माध्यम में वाई-27632, एक रॉक अवरोधक के अलावा त्वचा के ऊतकों10–-14से मानव प्राथमिक एपिडर्मल कोशिकाओं की उपज को बढ़ा सकते हैं। इसलिए, यह परीक्षण करना दिलचस्प होगा कि क्या मानव प्राथमिक मेलानोसाइट्स के अलगाव को वाई-27632 की उपस्थिति से लाभ होगा। दरअसल, टीका TIVA माध्यम15में वाई-27632 के अलावा, जिसमें टीपीए, आईबीएमएक्स,एनए 3वीओ4 और डीबीएएमपी शामिल हैं, ने प्रारंभिक संस्कृतियों में चमड़ी ऊतकों से अलग प्राथमिक मेलानोसाइट्स की उपज में काफी वृद्धि की16। पारंपरिक प्रोटोकॉल की तुलना में, यह नया प्रोटोकॉल मेलानोसाइट्स16की उपज बढ़ाने में काफी अधिक कुशल है। इसलिए, यह प्रोटोकॉल बुनियादी और लागू जैविक अनुसंधान में अपने आवेदन को बढ़ावा देने के लिए पिछले अध्ययन16 के आधार पर वयस्क त्वचा ऊतकों का उपयोग करके विस्तार से नई विधि का वर्णन करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां वर्णित प्रोटोकॉल हाल ही में16के प्रकाशन पर आधारित था । नई विधि के साथ सर्वोत्तम परिणाम प्राप्त करने के लिए निम्नलिखित महत्वपूर्ण चरणों पर कुछ ध्यान दिया जाना चाहिए। सबसे पहले, एपिडर्मिस ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्रमुख अनुसंधान और विकास कार्यक्रम (2017YFA0104604), चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (81772093), सैन्य रसद अनुसंधान परियोजना (AWS17J005), शेंडोंग प्रांत प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (ZR2019ZD36) के प्रमुख कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था और शेंडोंग प्रांत के प्रमुख अनुसंधान और विकास कार्यक्रम (२०१९GSF108107) X.W. गुआंगदोंग बेसिक और एप्लाइड बेसिक रिसर्च फाउंडेशन (2019A151110833) और शेंडोंग विश्वविद्यालय (२०१९GN043) के मौलिक अनुसंधान कोष जेएम के लिए
Materials
| Alexa fluor-594 donkey anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | A21203 | For Immunofluorescence |
| Alexa fluor-594 donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | R37119 | For Immunofluorescence |
| Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
| Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
| 15 mL Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
| 50 mL Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubating |
| Constant Temperature Shaker | Shanghai Boxun | 150036 | For water bath |
| DAPI | Abcam | ab104139 | For Immunofluorescence |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | For melanocyte isolation |
| DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
| Fluorescence microscope | Olympus | 5E44316 | For Immunofluorescence |
| Forskolin | MCE | HY-15371 | Induce pigmentation |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | melanocyte culture medium |
| Ham's F12 | Thermo Scientific | 11330032 | melanocyte culture medium |
| Inverted microscope | Olympus | 5C42258 | For cell microscopic observation |
| 3-isobutyl-1-methyl xanthine (IBMX) | Sigma | 17018 | melanocyte culture medium |
| mouse anti-human MITF | Abcam | ab12039 | For Immunofluorescence |
| Na3VO4 | Sigma | S6508 | melanocytes culture medium |
| N6,2'-O-dibutyryladeno-sine 3',5'-cyclic monophosphate (dbcAMP) | Sigma | D0627 | melanocyte culture medium |
| 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (TPA） | Sigma | 79346 | melanocyte culture medium |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
| rabbit anti-human Ki-67 | Abcam | ab15580 | For Immunofluorescence |
| Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifugation |
| TC20TM automated cell counter | Bio-Rad | 1450102 | Automatic cell counting |
| 0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For melanocyte dissociation |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | For melanocyte isolation |
Referências
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