Detta dokument rapporterar att tillägg av Y-27632 till TIVA medium kan avsevärt öka avkastningen av melanocyter från vuxna hudvävnader.
Isolering och kultur av primära melanocyter från hudvävnader är mycket viktigt för biologisk forskning och har använts i stor utsträckning för kliniska tillämpningar. Isolera primära melanocyter från hudvävnader med den konventionella metoden tar vanligtvis ca 3 till 4 veckor att passera tillräckligt. Ännu viktigare, de vävnader som används är oftast nyfödda förhud och det är fortfarande en utmaning att effektivt isolera primära melanocyter från vuxna vävnader. Vi har nyligen utvecklat en ny isoleringsmetod för melanocyter som lägger till Y-27632, en Rho kinashämmare, till det ursprungliga odlingsmediet för 48 h. Jämfört med det konventionella protokollet ökar denna nya metod dramatiskt avkastningen av melanocyter och förkortar den tid som krävs för att isolera melanocyter från förhudsvävnader. Vi beskriver nu denna nya metod mer i detalj med hjälp av vuxna epidermis att effektivt kultur primära melanocyter. Viktigt är att vi visar att melanocyter som erhållits från vuxna vävnader som utarbetats av denna nya metod kan fungera normalt. Detta nya protokoll kommer avsevärt att gynna studier av pigmentering defekter och melanom med hjälp av primära melanocyter som utarbetats från lättillgängliga vuxna hudvävnader.
Målet med denna studie var att utveckla ett enkelt och effektivt protokoll för att isolera melanocyter från epidermis av vuxen hud för biologisk forskning och kliniska tillämpningar. Melanocyter, som ligger i den basala epidermis av huden och i hårsäckarna, spelar en viktig roll i pigmentering av hud och hår genom att producera melanin1. Den resulterande hudpigmentering från epidermal melanocyter fungerar som en ultraviolett strålning filter som minskar / förhindrar DNA-skador på underliggande celler i huden2. Den onormala spridningen av melanocyter i huden är ganska vanligt, såsom i bildandet av godartade nevi (mol) där melanocyter potentiellt förvandlas till onkogen tillväxt följt av cellulär senescens3.
Sedan 1957 har isolering och efterföljande kultur av mänskliga primära melanocyter varit möjligt4, men först sedan 1982 har det funnits en effektiv metod som reproducerbart kan etablera kulturer av mänskliga melanocyter från epidermis5. Den konventionella metoden för att isolera primära melanocyter från epidermis innebär en två steg enzymatisk matsmältning. Kortfattat är huden först smält med dispase att skilja epidermis från dermis, varefter epidermis rötas med trypsin att producera suspensioner som innehåller melanocyter och keratinocyter, som sedan kan selektivt odlas i olika medier. För närvarande tar den ursprungliga kulturen vanligtvis ca 3 till 4 veckor för melanocyter att nå sammanflödet med den konventionella metoden, vilket sannolikt beror på den låga effektiviteten i deras isolering. Därför skulle öka den ursprungliga produktionen av melanocyter från vuxna hudvävnader vara till stor hjälp för både laboratorieforskning och kliniska tillämpningar.
Många tillväxtfaktorer, varav de flesta har visat sig utsöndras av keratinocyter (t.ex. α-MSH, ACTH, bFGF, NGF, ET-1, GM-CSF, HGF, LIF och SCF)5–8, reglerar differentiering och spridning av däggdjur melanocyter. I avsaknad av matarlager leder bristen på dessa tillväxtfaktorer till den minskade spridningen av melanocyter och deras ökade apoptos9. Samodlingen av keratinocyter som matarceller och melanocyter kan leda till accelererad melanocyte spridning och minskad apoptos. Men samkulturmetoden kräver inte bara fler hudvävnader för att förbereda keratinocyter, vilket inte är praktiskt, men också inte kunde fungera effektivt eftersom de kulturförhållanden som krävs av melanocyter inte gynnar keratinocyttillväxt, och vice versa.
Tidigare studier har rapporterat att tillägg av Y-27632, en ROCK-hämmare, i tillväxtmediet kan öka avkastningen av mänskliga primära epidermala celler från hudvävnader10–14. Därför skulle det vara intressant att testa om isoleringen av mänskliga primära melanocyter skulle dra nytta av förekomsten av Y-27632. Faktum är att tillägg av Y-27632 i inokulering TIVA medium15, som innehåller TPA, IBMX, Na3VO4 och dbcAMP, avsevärt ökat avkastningen av primära melanocyter isolerade från förhud vävnader i de ursprungliga kulturerna16. Jämfört med det konventionella protokollet är detta nya protokoll betydligt effektivare när det gäller att öka avkastningen av melanocyter16. Därför beskriver detta protokoll den nya metoden i detalj med hjälp av vuxna hudvävnader baserade på en tidigare studie16 för att främja dess tillämpning i grundläggande och tillämpad biologisk forskning.
Det protokoll som beskrivs här baserades på en nyligen publicerad16. Viss uppmärksamhet bör ägnas åt följande kritiska steg för att uppnå bästa resultat med den nya metoden. För det första är framgångsrik separation av epidermis och dermis avgörande. Skär den vuxna förhuden vävnader i 3-4 mm breda remsor med hjälp av en skalpell blad för att göra dispas arbete mer noggrant och enkelt att skilja epidermis från dermis. För det andra, när separera dessa två lager, bör kontam…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av Kinas nationella nyckelforsknings- och utvecklingsprogram (2017YFA0104604), The General Program of National Natural Science Foundation of China (81772093), Military Logistics Research Project (AWS17J005), key program of Shandong Province Natural Science Foundation (ZR2019ZD36) och det viktigaste forsknings- och utvecklingsprogrammet för provinsen Shandong (2019GSF108107) till X.W. Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (2019A1515110833) och Grundforskningsfonderna vid Shandong University (2019GN043) till J.M.
Alexa fluor-594 donkey anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | A21203 | For Immunofluorescence |
Alexa fluor-594 donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | R37119 | For Immunofluorescence |
Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
15 mL Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
50 mL Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubating |
Constant Temperature Shaker | Shanghai Boxun | 150036 | For water bath |
DAPI | Abcam | ab104139 | For Immunofluorescence |
Dispase | Gibco | 17105-041 | For melanocyte isolation |
DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
Fluorescence microscope | Olympus | 5E44316 | For Immunofluorescence |
Forskolin | MCE | HY-15371 | Induce pigmentation |
Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | melanocyte culture medium |
Ham's F12 | Thermo Scientific | 11330032 | melanocyte culture medium |
Inverted microscope | Olympus | 5C42258 | For cell microscopic observation |
3-isobutyl-1-methyl xanthine (IBMX) | Sigma | 17018 | melanocyte culture medium |
mouse anti-human MITF | Abcam | ab12039 | For Immunofluorescence |
Na3VO4 | Sigma | S6508 | melanocytes culture medium |
N6,2'-O-dibutyryladeno-sine 3',5'-cyclic monophosphate (dbcAMP) | Sigma | D0627 | melanocyte culture medium |
12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (TPA) | Sigma | 79346 | melanocyte culture medium |
Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
rabbit anti-human Ki-67 | Abcam | ab15580 | For Immunofluorescence |
Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifugation |
TC20TM automated cell counter | Bio-Rad | 1450102 | Automatic cell counting |
0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For melanocyte dissociation |
Y-27632 | Sigma | Y0503 | For melanocyte isolation |