Valutazione dell'ossidazione cellulare utilizzando una proteina fluorescente verde sensibile al comparto subcellulare

Summary

Questo protocollo descrive la valutazione dello stato di redox subcellulare specifico del compartimento all’interno della cella. Una sonda fluorescente redox-sensibile consente una comoda analisi ratiometrica nelle cellule intatte.

Abstract

Misurare l’equilibrio di ossidazione/riduzione intracellulare fornisce una panoramica dello stato di redox fisiologico e/o patofisiologico di un organismo. I thiol sono particolarmente importanti per illuminare lo stato di ripetizione delle cellule attraverso i loro rapporti dithiol ridotti e disulfide ossidati. Le proteine fluorescenti contenenti cisteina ingegnerizzate aprono una nuova era per i biosensori sensibili ai redox. Una di queste, la proteina fluorescente verde sensibile alla redox (roGFP), può essere facilmente introdotta nelle cellule con trasduzione adenovirale, consentendo di valutare lo stato di ripetizione dei compartimenti subcellulari senza interrompere i processi cellulari. Cistein e cistino ossidati di roGFP hanno massimali di eccitazione a 488 nm e 405 nm, rispettivamente, con emissione a 525 nm. La valutazione dei rapporti di queste forme ridotte e ossidati consente il comodo calcolo dell’equilibrio redox all’interno della cella. In questo articolo di metodo, le cellule umane di cancro al seno tripla-negativa (MDA-MB-231) sono state utilizzate per valutare lo stato di redox all’interno della cellula vivente. I passaggi del protocollo includono la trasduzione della linea cellulare MDA-MB-231 con adenovirus per esprimere il citosolico roGFP, il trattamento con H₂O₂e la valutazione del rapporto di cisteina e cistina con la citometria del flusso e la microscopia a fluorescenza.

Introduction

Lo stress ossidativo è stato definito nel 1985 da Helmut Sies come “un disturbo nell’equilibrio proossidante-antiossidante a favore del primo”¹, ed è stata condotta una pletora di ricerca per ottenere lo stato di ridonazione della malattia^1,2,3. Da allora, la comprensione dello stress ossidativo è diventata più ampia. Testare le ipotesi di utilizzare antiossidanti contro malattie e/o invecchiamento ha dimostrato che lo stress ossidativo non solo provoca danni, ma ha anche altri ruoli nelle cellule. Inoltre, gli scienziati hanno dimostrato che i radicali liberi svolgono un ruolo importante per la trasduzione del segnale². Tutti questi studi rafforzano l’importanza di determinare i cambiamenti nel rapporto riduzione-ossidazione (redox) delle macromolecole. L’attività enzimatica, gli antiossidanti e/o gli ossidanti e i prodotti di ossidazione possono essere valutati con vari metodi. Tra questi, i metodi che determinano l’ossidazione del tiolo sono probabilmente i più utilizzati perché riferiscono sull’equilibrio tra antiossidanti e proossidanti nelle cellule, così come gli organismi⁴. In particolare, i rapporti tra glutathione (GSH)/glutathione disulfide (GSSG) e/o cisteina (CyS)/cistine (CySS) sono utilizzati come biomarcatori per monitorare lo stato di redox degli organismi².

I metodi utilizzati per analizzare l’equilibrio tra proossidanti e antiossidanti si basano principalmente sui livelli di proteine ridotte/ossidizzate o piccole molecole all’interno delle cellule. Le macchie occidentali e la spettrometria di massa sono utilizzate per valutare ampiamente i rapporti di macromolecole ridotte/ossidati (proteine, lipidi, ecc.), e i rapporti GSH/GSSG possono essere valutati con spettrofotometria⁵. Una caratteristica comune di questi metodi è la perturbazione fisica del sistema da parte della lisi cellulare e/o omogeneizzazione dei tessuti. Queste analisi diventano anche difficili quando è necessario misurare lo stato di ossidazione di diversi compartimenti cellulari. Tutte queste perturbazioni causano artefatti nell’ambiente di assaggio.

Le proteine fluorescenti redox-sensibili hanno aperto un’era vantaggiosa per valutare l’equilibrio redox senza causare disturbi nelle cellule⁶. Possono colpire diversi compartimenti intracellulari, permettendo la quantificazione delle attività specifiche del compartimento (ad esempio, secondo lo stato di ripetizione dei mitocondri e del citosol) per studiare il crosstalk tra organelli cellulari. Le proteine fluorescenti gialle (YFP), le proteine fluorescenti verdi (GFP) e le proteine HyPeR sono esaminate da Meyer e colleghi⁶. Tra queste proteine, GFP sensibile al redox (roGFP) è unica a causa delle diverse letture fluorescenti del suo CyS (ad es. 488 nm/em. 525 nm) e CySS (ex. 405 nm/525 nm) residui, che consentono l’analisi ratiometrica, a differenza di altre proteine sensibili ai redox come YFP^7,8. L’output ratiometrico è utile perché controbilancia le differenze tra i livelli di espressione, le sensibilità al rilevamento e il fotosbiancamento^{8 .} Comparti subcellulari di cellule (citosol, mitocondri, nucleo) o organismi diversi (batteri e cellule di mammiferi) possono essere presi di mira modificando roGFP^7,9,10.

I test roGFP sono condotti utilizzando tecniche di imaging fluorescente, in particolare per esperimenti di visualizzazione in tempo reale. Le analisi citometriche a flusso dei roGP sono possibili anche per esperimenti con punti temporali predeterminati. L’articolo corrente descrive sia l’uso della microscopia fluorescente e della citometria di flusso per eseguire una valutazione ratiometrica dello stato di redox nelle cellule dei mammiferi che sovraesprimono roGFP (mirato al citosol) attraverso la trasduzione adenovirale.

Protocol

NOTA: questo protocollo è stato ottimizzato per le celle MDA-MB-231 confluenti 70%-80%. Per altre linee cellulari, il numero di cellule e la molteplicità di infezione (MOI) dovrebbero essere ottimizzati nuovamente. 1. Preparazione delle cellule (giorno 1) Mantenere la linea cellulare MDA-MB-231 in flaconi da 75 cm2 con 10 mL del mezzo Eagle (DMEM) modificato di Dulbecco, integrato con 10% di siero bovino fetale (FBS) a 37 gradi centigradi in un’atmosfera umidificata di C…

Representative Results

Lo stato di redox di CyS/CySS è facilmente divformato con roGP trasdotti. La sonda fluorescente quantifica il rapporto tra le forme ridotte e ossidate (lunghezze d’onda di eccitazione rispettivamente 488 e 405 nm). I dati di fluorescenza possono essere ottenuti sia dalla citometria del flusso che dalla microscopia. Un gran numero di cellule può essere acquisita in modo coerente e conveniente utilizzando la citometria di flusso. L’analisi è costituita da 3 passaggi principali: 1) selezionare…

Discussion

L’equilibrio tiol/disulfide in un organismo riflette lo stato di ripetizione delle cellule. Gli organismi viventi hanno glutathione, cisteina, tiol proteici e tioli a basso peso molecolare, tutti influenzati dal livello di ossidazione e riecheggiano lo stato di redox delle cellule⁴. I roGFP ingegnerizzati consentono la quantificazione non dirompente dell’equilibrio tiolo/disulfide attraverso i loro residui di CyS⁷. La proprietà ratiometrica di roGFP fornisce misurazioni af…

Materials

0.25% Trypsin-EDTA	Gibco by Life Sciences	25200-056	Cell culture
4-well chamber slide	Thermo Scientific	154526	Cell seeding material for fluorescent imaging
5 ml tubes with cell strainer cap	Falcon	352235	Single cell suspension tube for flow cytometry analysis
6-well plate	Corning	353046	Cell seeding material for flow cytometry analysis
15 ml conical tubes	MidSci	C15B	Cell culture
75 cm2 ventilated cap tissue culture flasks	Corning	4306414	Cell culture
Adenoviral cytosol specific roGFP	ViraQuest	VQAd roGFP	roGFP construct kindly provided by Dr. Schumaker
Class II, Type A2 Safety Hood Cabinet	Thermo Scientific	1300 Series A2	Cell culture
Countess automated cell counter	Invitrogen	C10227	Cell counting
Countess cell counter chamber slides	Invitrogen	C10283	Cell counting
DMEM	Gibco by Life Sciences	11995-065	Cell culture
FBS	Atlanta Biologicals	S11150	Cell culture
Filtered pipette tips, sterile, 20 µl	Fisherbrand	02-717-161	Cell culture
Filtered pipette tips, sterile, 1000 µl	Fisherbrand	02-717-166	Cell culture
Flow Cytometer	BD Biosciences	LSRFortessa	Instrument equipped with FITC and BV510 bandpass filters for flow cytometry analyses
Fluorescent Microscope	Advanced Microscopy Group (AMG)	Evos FL	Fluorescent imaging
Hydrogen Peroxide 30%	Fisher Scientific	H325-100	Positive control
Light Cube, Custom	Life Sciences	CUB0037	Fluorescent imaging of roGFP expressing cells (ex 405 nm)
Light Cube, GFP	Thermo Scientific	AMEP4651	Fluorescent imaging of roGFP expressing cells (ex 488 nm)
MDA-MB-231	American Tissue Culture Collection	HTB-26	Human epithelial breast cancer cell line
Microcentrifuge tubes, 2 ml	Grenier Bio-One	623201	Cell culture
PBS	Gibco by Life Sciences	10010-023	Cell culture
Pipet controller	Drummond	Hood Mate Model 360	Cell culture
Serologycal pipet, 1 ml	Fisherbrand	13-678-11B	Cell culture
Serologycal pipet, 5 ml	Fisherbrand	13-678-11D	Cell culture
Serologycal pipet, 10 ml	Fisherbrand	13-678-11E	Cell culture
Tissue Culture Incubator	Thermo Scientific	HERACell 150i	CO2 incubator for cell culture
Trypan blue stain 0.4%	Invitrogen	T10282	Cell counting