Vurdering av cellulær oksidasjon ved hjelp av et subcellulært romspesifikt Redox-Sensitive Green Fluorescerende protein

Summary

Denne protokollen beskriver vurderingen av subcellulær romspesifikk redoksstatus i cellen. En redoksfølsom fluorescerende sonde gir praktisk ratiometrisk analyse i intakte celler.

Abstract

Måling av den intracellulære oksidasjons-/reduksjonsbalansen gir en oversikt over organismens fysiologiske og/eller patofysiologiske redoksstatus. Tioler er spesielt viktige for å belyse redoksstatusen til celler via deres reduserte dithiol og oksiderte disulfidforhold. Konstruerte cysteinholdige fluorescerende proteiner åpner en ny æra for redoksfølsomme biosensorer. En av dem, redoks-sensitive grønne fluorescerende protein (roGFP), kan lett innføres i celler med adenoviral transduksjon, slik at redoksstatusen til subcellulære rom kan evalueres uten å forstyrre cellulære prosesser. Redusertcysteiner og oksiderte cystiner av roGFP har eksitasjon maxima på henholdsvis 488 nm og 405 nm, med utslipp på 525 nm. Vurdering av forholdet mellom disse reduserte og oksiderte formene gjør det mulig å beregne redoksbalansen i cellen. I denne metodeartikkelen ble udødeliggjorte humane trippelnegative brystkreftceller (MDA-MB-231) brukt til å vurdere redoksstatus i den levende cellen. Protokollen trinnene inkluderer MDA-MB-231 cellelinje transduksjon med adenovirus å uttrykke cytosolic roGFP, behandling med H₂O_2,og vurdering av cystein og cystin forhold med både strømning cytometri og fluorescens mikroskopi.

Introduction

Oksidativt stress ble definert i 1985 av Helmut Sies som “en forstyrrelse i prooksidant-antioksidantbalanse i favør av den tidligere”¹, og en mengde forskning har blitt utført for å oppnå sykdom-, ernæring-, og aldringsspesifikk redoksstatus av^{organismer 1,2,3}. Siden da har forståelsen av oksidativt stress blitt bredere. Testing av hypotesene ved å bruke antioksidanter mot sykdommer og/ eller aldring har vist at oksidativt stress ikke bare forårsaker skade, men har også andre roller i celler. Videre har forskere vist at frie radikaler spiller en viktig rolle for signaltransduksjon². Alle disse studiene styrker viktigheten av å bestemme endringene i reduksjonsoksidasjonsforholdet (redoks) av makromolekyler. Enzymaktivitet, antioksidanter og/eller oksidanter og oksidasjonsprodukter kan vurderes med ulike metoder. Blant disse er metoder som bestemmer tioloksidasjon uten tvil den mest brukte fordi de rapporterer om balansen mellom antioksidanter og prooksidanter i celler, samt^{organismer 4}. Spesielt brukes forhold mellom glutation (GSH)/glutationdisulfid (GSSG) og/eller cystein (CyS)/cystin (CySS) som biomarkører for overvåking av redoksstatusen til^{organismer 2}.

Metoder som brukes til å analysere balansen mellom prooksidanter og antioksidanter, er hovedsakelig avhengig av nivåene av reduserte/oksiderte proteiner eller små molekyler i celler. Vestlige blots og massespektrometri brukes til å bredt vurdere forholdet mellom reduserte / oksiderte makromolekyler (protein, lipider etc.), og GSH / GSSG-forhold kan vurderes med spektrofotometri⁵. Et vanlig trekk ved disse metodene er den fysiske perturbasjonen av systemet ved cellelysis og / eller vev homogenisering. Disse analysene blir også utfordrende når det er nødvendig å måle oksidasjonsstatusen til forskjellige cellulære rom. Alle disse perturbasjonene forårsaker artefakter i analysemiljøet.

Redox-sensitive fluorescerende proteiner åpnet en fordel for evaluering av redoksbalansen uten å forårsake forstyrrelser i cellene⁶. De kan målrette mot ulike intracellulære rom, slik at kvantifisering av kupéspesifikke aktiviteter (f.eks. analysere redokstilstanden til mitokondrier og cytosol) for å undersøke krysstale mellom cellulære organeller. Gult fluorescerende protein (YFP), grønt fluorescerende protein (GFP) og HyPeR-proteiner gjennomgås av Meyer og kolleger⁶. Blant disse proteinene er redoksfølsomme GFP (roGFP) unike på grunn av forskjellige fluorescerende avlesninger av cys (f. 488 nm/em. 525 nm) og CySS (f.eks. 405 nm/525 nm) rester, som tillater ratiometrisk analyse, i motsetning til andre redoks-sensitive proteiner som YFP^7,8. Ratiometrisk utdata er verdifull fordi den motvekter forskjellene mellom uttrykksnivåer, deteksjonsfølsomheter og fotobleking⁸. Subcellulære celleavdelinger (cytosol, mitokondrier, kjerne) eller forskjellige organismer (bakterier samt pattedyrceller) kan målrettes ved å endre roGFP^7,,9,,10.

roGFP-analyser utføres ved hjelp av fluorescerende bildeteknikker, spesielt for visualiseringseksperimenter i sanntid. Flow cytometriske analyser av roGFPs er også mulig for eksperimenter med forhåndsbestemte tidspunkter. Den nåværende artikkelen beskriver både bruk av fluorescerende mikroskopi og strømningscytometri for å utføre en ratiometrisk vurdering av redoksstatus hos pattedyrceller som overexpressing roGFP (målrettet mot cytosol) via adenoviral transduging.

Protocol

MERK: Denne protokollen ble optimalisert for 70 %–80 % sammenføyning av MDA-MB-231-celler. For andre cellelinjer bør antall celler og mangfold av infeksjon (MOI) reoptimeres på nytt. 1. Utarbeidelse av celler (dag 1) Vedlikehold MDA-MB-231 cellelinje i 75 cm2 flasker med 10 ml Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) supplert med 10% fostervin serum (FBS) ved 37 °C i en 5% CO2 fuktet atmosfære.MERK: DMEM supplert med 10 % FBS, 37 °C og en 5 % CO<sub…

Representative Results

Redokstilstanden til CyS/CySS analyseres lett med transdusert roGFPs. Den fluorescerende sonden kvantifiserer forholdet mellom de reduserte og oksiderte formene (eksitasjonsbølgelengder henholdsvis 488 nm og 405 nm). Fluorescensdata kan innhentes ved både strømningscytometri og mikroskopi. Et stort antall celler kan konsekvent og praktisk anskaffes ved hjelp av strømningscytometri. Analysen består av 3 hovedtrinn: 1) velg cellepopulasjonen av interesse med FSC-områdefilteret (<strong cla…

Discussion

Tiol/disulfidbalansen i kroppen reflekterer rødoksstatusen til celler. Levende organismer har glutation, cystein, proteintioler og lavmolekylærvekttioler, som alle påvirkes av oksidasjonsnivået og ekko redoksstatusen til celler⁴. Konstruerte roGFPs tillater ikke-forstyrrende kvantifisering av tiol/disulfidbalansen via cysestene⁷. Den forholdsmetriske egenskapen til roGFP gir pålitelige redoksmålinger for pattedyrceller. roGFP kan enkelt introduseres i celler med trans…

Materials

0.25% Trypsin-EDTA	Gibco by Life Sciences	25200-056	Cell culture
4-well chamber slide	Thermo Scientific	154526	Cell seeding material for fluorescent imaging
5 ml tubes with cell strainer cap	Falcon	352235	Single cell suspension tube for flow cytometry analysis
6-well plate	Corning	353046	Cell seeding material for flow cytometry analysis
15 ml conical tubes	MidSci	C15B	Cell culture
75 cm2 ventilated cap tissue culture flasks	Corning	4306414	Cell culture
Adenoviral cytosol specific roGFP	ViraQuest	VQAd roGFP	roGFP construct kindly provided by Dr. Schumaker
Class II, Type A2 Safety Hood Cabinet	Thermo Scientific	1300 Series A2	Cell culture
Countess automated cell counter	Invitrogen	C10227	Cell counting
Countess cell counter chamber slides	Invitrogen	C10283	Cell counting
DMEM	Gibco by Life Sciences	11995-065	Cell culture
FBS	Atlanta Biologicals	S11150	Cell culture
Filtered pipette tips, sterile, 20 µl	Fisherbrand	02-717-161	Cell culture
Filtered pipette tips, sterile, 1000 µl	Fisherbrand	02-717-166	Cell culture
Flow Cytometer	BD Biosciences	LSRFortessa	Instrument equipped with FITC and BV510 bandpass filters for flow cytometry analyses
Fluorescent Microscope	Advanced Microscopy Group (AMG)	Evos FL	Fluorescent imaging
Hydrogen Peroxide 30%	Fisher Scientific	H325-100	Positive control
Light Cube, Custom	Life Sciences	CUB0037	Fluorescent imaging of roGFP expressing cells (ex 405 nm)
Light Cube, GFP	Thermo Scientific	AMEP4651	Fluorescent imaging of roGFP expressing cells (ex 488 nm)
MDA-MB-231	American Tissue Culture Collection	HTB-26	Human epithelial breast cancer cell line
Microcentrifuge tubes, 2 ml	Grenier Bio-One	623201	Cell culture
PBS	Gibco by Life Sciences	10010-023	Cell culture
Pipet controller	Drummond	Hood Mate Model 360	Cell culture
Serologycal pipet, 1 ml	Fisherbrand	13-678-11B	Cell culture
Serologycal pipet, 5 ml	Fisherbrand	13-678-11D	Cell culture
Serologycal pipet, 10 ml	Fisherbrand	13-678-11E	Cell culture
Tissue Culture Incubator	Thermo Scientific	HERACell 150i	CO2 incubator for cell culture
Trypan blue stain 0.4%	Invitrogen	T10282	Cell counting