Isolement des noyaux de tissus adipeux pour applications génomiques unicellulaires
Summary
Cette publication décrit un protocole pour l’isolement des noyaux des adipocytes matures, la purification par le tri activé par fluorescence, et la transcriptomique de niveau unicellulaire.
Abstract
Les graisses brunes et beiges sont des tissus adipeux spécialisés qui dissipent l’énergie pour la thermogenèse par ucp1 (Uncoupling Protein-1) –voies indépendantes. Jusqu’à récemment, les adipocytes thermogéniques étaient considérés comme une population homogène. Cependant, des études récentes ont indiqué qu’il existe plusieurs sous-types ou sous-populations qui sont distincts dans l’origine développementale, l’utilisation du substrat, et le transcriptome. Malgré les progrès de la génomique unicellulaire, la décomposition impartiale des tissus adipeux en sous-types cellulaires a été difficile en raison de la nature fragile des adipocytes remplis de lipides. Le protocole présenté a été développé pour contourner ces obstacles par l’isolement efficace des noyaux simples des tissus adipeux pour les applications en aval, y compris le séquençage de l’ARN. L’hétérogénéité cellulaire peut ensuite être analysée par séquençage de l’ARN et des analyses bioinformatiques.
Introduction
Des études ont montré que le tissu adipeux brun (BAT) a une capacité remarquable de dissiper l’énergie. Deux types d’adipocytes thermogéniques avec des caractéristiques développementales distinctes existent chez les rongeurs et les humains : les adipocytes beiges et les adipocytes bruns classiques. Alors que les adipocytes bruns classiques sont situés principalement dans les dépôts de BAT interscapulaires, les adipocytes beiges émergent sporadiquement dans le tissu adipeux blanc (WAT) en réponse à certains indices physiologiques, tels que l’exposition chronique au froid, un processus appelé « brunissement » ou « beiging ». Grâce à l’utilisation de l’imagerie avancée, il est maintenant clair que les humains adultes ont des dépôts substantiels de UCP1+ BAT, en particulier dans la région supraclaviciculaire1,2,3,4. La quantité de BAT humain adulte est inversement corrélée avec l’adiposité et peut être augmentée par des signaux externes, tels que l’exposition chronique au froid5,,6 ou β3-adrénergique récepteur agoniste7. Les dépenses énergétiques sous médiation du BAT peuvent offrir une approche viable pour lutter contre l’obésité.
Jusqu’à récemment, les adipocytes thermogéniques étaient considérés comme une population homogène. Cependant, des études ont révélé l’existence de plusieurs sous-types ou sous-populations distincts dans l’origine développementale, l’utilisation du substrat et le transcriptome8,9,10. Par exemple, un type d’adipocyte beige qui utilise de préférence le glucose pour la thermogenèse, l’adipocyte g-beige, a été récemment décrit10. La compréhension incomplète des types de cellules dans les tissus adipeux bruns et beiges et l’absence de marqueurs spécifiques constituent une barrière critique à l’étude de leurs fonctions biologiques.
Les méthodes traditionnelles d’isolement des sous-populations de cellules sont basées sur l’expression de quelques gènes marqueurs connus. Les progrès récents en génomique unicellulaire permettent l’utilisation de données d’expression génique globale de cellules uniques pour fournir une estimation impartiale du nombre de sous-populations dans un tissu. Le but ultime de ce protocole est de déterminer tous les sous-types de tissus adipeux sous divers stimuli thermogéniques à une résolution unicellulaire. Contrairement à d’autres tissus et types de cellules, la détermination des sous-types cellulaires du tissu adipeux est difficile en raison de la fragilité des adipocytes remplis de lipides. Cet article introduit un protocole robuste pour isoler les noyaux simples du tissu adipeux pour l’application en aval au séquençage de l’ARN. Fait important, la littérature récente comparant le séquençage de l’ARN uni-noyaux (snRNA-seq) et les ensembles de données de séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNA-seq) ont révélé que le snRNA-seq est comparable au scRNA-seq dans la détection de type cellulaire, et supérieur dans la couverture cellulaire pour un tissu complexe comme le cerveau11. Ce protocole combine une méthode de centrifugation de gradient de densité optimisée pour les tissus adipeux par Rosen et al.12 avec une étape de « nettoyage » de noyaux avec un trieur à grande vitesse MoFlo XDP. Comme on le voit dans les résultats représentatifs, une analyse de 7 500 noyaux simples provenant du tissu adipeux brun intercapulaire de souris a identifié plusieurs types de cellules dans des adipocytes bruns apparemment homogènes. Dans l’ensemble, ce protocole simple et robuste peut être appliqué à l’organisation au niveau tissulaire des adipocytes et des cellules adipose-résidentes, à l’identification des gènes marqueurs spécifiques au sous-type et au phénotypage de développement des souris adipeuses sélectives par KO/transgéniques.
Protocol
Representative Results
Discussion
Une méthode simple et robuste pour isoler les noyaux simples et étudier l’hétérogénéité des tissus adipeux est présentée. Comparé au séquençage de l’ARN des tissus entiers, ce flux de travail offre une vue impartiale de l’hétérogénéité cellulaire et des marqueurs spécifiques à la population. Ceci est significatif et novateur pour l’avancement de la biologie des adipocytes, du métabolisme moléculaire et de la recherche sur l’obésité.
Ce protocole est particuliè…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier David Reynolds du noyau Albert Einstein Genomics et Jinghang Zhang du Flow Cytometry Core pour son soutien technique. Nous reconnaissons le soutien des National Institutes of Health (NIH) (DK110426) et des subventions pilotes et de faisabilité du Centre de recherche sur le diabète Einstein-Mount Sinai (DK020541) et du New York Obesity Research Center (DK026687) (tous à K.S.). Nous tenons également à remercier Albert Einstein Cancer Center (CA013330) pour le soutien de base.
Materials
| autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | PBS with EDTA; sterile-filtered |
| BSA | Sigma | A1595 | |
| CaCl2 | Sigma | 21115 | |
| Cell filter 100 μm | Corning | 431752 | |
| Cell filter 40μm | Corning | 431750 | |
| CellTrics (30 μm) | Sysmex | 04-004-2326 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF1000 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KCl | Fisher | P217-3 | |
| MACS SmartStrainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | Stackable filters |
| MgCl2 | Sigma | M1028 | |
| MoFloXDP Cell Sorter | Beckman Coulter | ML99030 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| Protector RNase Inhibitor | Roche | 3335402001 | |
| Sucrose | Fisher | S5-3 |
Referências
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