Esta publicação descreve um protocolo para o isolamento de núcleos de adipócitos maduros, purificação por classificação ativada por fluorescência e transcrição de nível unicelular.
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Artigo de método
Isolamento dos núcleos tecilódico adiposos para aplicações genômicas unicelulares
Neste artigo
Resumo
Resumo
A gordura marrom e bege são tecidos adiposos especializados que dissipam energia para termogênese pela UCP1 (Uncoupling Protein-1) -dependent and independent pathways. Até recentemente, os adipócitos termogênicos eram considerados uma população homogênea. No entanto, estudos recentes indicaram que existem múltiplos subtipos ou subpopulações que são distintos na origem do desenvolvimento, uso de substrato e transcriptome. Apesar dos avanços na genômica unicelular, a decomposição imparcial dos tecidos adiposos em subtipos celulares tem sido desafiadora devido à natureza frágil dos adipócitos preenchidos com lipídios. O protocolo apresentado foi desenvolvido para contornar esses obstáculos pelo isolamento efetivo de núcleos únicos do tecido adiposo para aplicações a jusante, incluindo sequenciamento de RNA. A heterogeneidade celular pode então ser analisada por sequenciamento de RNA e análises bioinformáticas.
Introdução
Estudos mostraram que o tecido adiposo marrom (BAT) tem uma capacidade notável de dissipar energia. Dois tipos de adipócitos termogênicos com características distintas do desenvolvimento existem tanto em roedores quanto em humanos: adipócitos bege e adipócitos marrons clássicos. Enquanto os adipócitos marrons clássicos estão localizados principalmente em depósitos de BAT interscapulares, adipócitos beges emergem esporadicamente em tecido adiposo branco (WAT) em resposta a certos sinais fisiológicos, como exposição ao frio crônico, um processo chamado de "browning" ou "beiging". Através do uso de imagens avançadas, agora está claro que os seres humanos adultos possuem ....
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Protocolo
O cuidado e a experimentação em animais foram realizados de acordo com os procedimentos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Faculdade de Medicina Albert Einstein.
1. Preparação de tampões de digestão tecidual e lise
- Prepare o tampão de digestão do tecido.
- Prepare ~1 mL de tampão de digestão para cada grama de tecido adiposo.
- Pesar 1,5 U/mL colagenase D e 2,4 U/mL dispase II e adicionar soro fisiológico tamponado fosfato (PBS).
- Prepare o tampão de preparação dos núcleos (NPB).
- Prepare 10 mM HEPES, 1,5 mM cloreto de magnésio, cloreto de potássio de 10 ....
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Resultados
Núcleos adipócitos não variados contêm detritos e doublets que criam ruído e fundo alto no sequenciamento de RNA de célula única a jusante. A estratégia representativa do portão FACS é mostrada na Figura 1. Os núcleos foram selecionados primeiro com base na dispersão dianteira (FSC) e dispersão lateral (SSC) (A),depois, apenas singlets foram selecionados com base na combinação de largura e alturas de SSC (B). Finalmente, apen.......
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Discussão
Um método simples e robusto para isolar núcleos únicos e estudar a heterogeneidade do tecido adiposo é apresentado. Comparado ao sequenciamento de RNA de tecido inteiro, este fluxo de trabalho oferece uma visão imparcial da heterogeneidade celular e marcadores específicos da população. Isso é significativo e inovador para o avanço da biologia adipócito, metabolismo molecular e pesquisa sobre obesidade.
Este protocolo é particularmente otimizado para a aplicação a jusante de snRNA-seq. O passo .......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer a David Reynolds do núcleo de Genômica Albert Einstein e Jinghang Zhang do Núcleo de Citometria de Fluxo pelo apoio técnico. Reconhecemos o apoio dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) (DK110426) e do Pilot and Feasibility Grants do Einstein-Mount Sinai Diabetes Research Center (DK020541) e do New York Obesity Research Center (DK026687) (todos para K.S.). Também gostaríamos de agradecer ao Albert Einstein Cancer Center (CA013330) pelo apoio do núcleo.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Solução de Enxágue autoMACS | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | PBS com EDTA; filtro de |
| BSA | Sigma | A1595 | |
| CaCl2 | Sigma | 21115 | |
| estéril 100 μ m | Corning | 431752 | |
| Cell filter 40μ m | Corning | 431750 | |
| CellTrics (30 μ m) | Sysmex | 04-004-2326 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| Condessa II FL Contador de Células Automatizado | Invitrogen | AMQAF1000 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KCl | Fisher | P217-3 | |
| MACS SmartStrainers (30 µ m) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | Filtros empilháveis |
| MgCl2 | Sigma | M1028 | |
| MoFloXDP Cell Sorter | Beckman Coulter | ML99030 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| Protetor Inibidor de RNase | Roche | 3335402001 | |
| Sacarose | Fisher | S5-3 |
Referências
- Cypess, A. M., et al. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1509-1517 (2009).
- van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. Cold-activated brown adipose tissue in....
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Reimpressões e permissões
