Isolamento dos núcleos tecilódico adiposos para aplicações genômicas unicelulares
Summary
Esta publicação descreve um protocolo para o isolamento de núcleos de adipócitos maduros, purificação por classificação ativada por fluorescência e transcrição de nível unicelular.
Abstract
A gordura marrom e bege são tecidos adiposos especializados que dissipam energia para termogênese pela UCP1 (Uncoupling Protein-1) -dependent and independent pathways. Até recentemente, os adipócitos termogênicos eram considerados uma população homogênea. No entanto, estudos recentes indicaram que existem múltiplos subtipos ou subpopulações que são distintos na origem do desenvolvimento, uso de substrato e transcriptome. Apesar dos avanços na genômica unicelular, a decomposição imparcial dos tecidos adiposos em subtipos celulares tem sido desafiadora devido à natureza frágil dos adipócitos preenchidos com lipídios. O protocolo apresentado foi desenvolvido para contornar esses obstáculos pelo isolamento efetivo de núcleos únicos do tecido adiposo para aplicações a jusante, incluindo sequenciamento de RNA. A heterogeneidade celular pode então ser analisada por sequenciamento de RNA e análises bioinformáticas.
Introduction
Estudos mostraram que o tecido adiposo marrom (BAT) tem uma capacidade notável de dissipar energia. Dois tipos de adipócitos termogênicos com características distintas do desenvolvimento existem tanto em roedores quanto em humanos: adipócitos bege e adipócitos marrons clássicos. Enquanto os adipócitos marrons clássicos estão localizados principalmente em depósitos de BAT interscapulares, adipócitos beges emergem esporadicamente em tecido adiposo branco (WAT) em resposta a certos sinais fisiológicos, como exposição ao frio crônico, um processo chamado de “browning” ou “beiging”. Através do uso de imagens avançadas, agora está claro que os seres humanos adultos possuem depósitos substanciais de UCP1+ BAT, especialmente na região supraclavicular1,,2,,3,4. A quantidade de BAT humano adulto se correlaciona inversamente com adiposidade e pode ser aumentada por pistas externas, como exposição ao frio crônico5,,6 ou β3-adrenergic receptor agonista7. O gasto energético mediado pelo BAT pode oferecer uma abordagem viável para combater a obesidade.
Até recentemente, os adipócitos termogênicos têm sido considerados uma população homogênea. No entanto, estudos revelaram a existência de múltiplos subtipos ou subpopulações distintas em origem desenvolvimento, uso de substrato e transcriptome8,,9,,10. Por exemplo, um tipo de adipócito bege que usa preferencialmente glicose para termogênese, o adipócito g-bege, foi recentemente descrito10. A compreensão incompleta dos tipos celulares no tecido adiposo marrom e bege e a falta de marcadores específicos constituem uma barreira crítica para estudar suas funções biológicas.
Os métodos tradicionais para isolar subpopulações de células são baseados na expressão de apenas alguns genes marcadores conhecidos. Os recentes avanços na genômica unicelular permite o uso de dados globais de expressão genética de células únicas para fornecer uma estimativa imparcial do número de subpopulações em um tecido. O objetivo final deste protocolo é determinar todos os subtipos de tecido adiposo sob vários estímulos termogênicos em uma resolução unicelular. Em contraste com outros tecidos e tipos celulares, determinar subtipos celulares de tecido adiposo é desafiador devido à fragilidade dos adipócitos preenchidos com lipídios. Este artigo introduz um protocolo robusto para isolar núcleos únicos do tecido adiposo para aplicação a jusante ao sequenciamento snRNA. É importante ressaltar que a literatura recente comparando o sequenciamento de RNA uninuclei bem combinado (snRNA-seq) e os conjuntos de dados de sequenciamento de RNA unicelular (scRNA-seq) revelaram que o snRNA-seq é comparável ao scRNA-seq na detecção do tipo celular e superior na cobertura celular para um tecido complexo como o cérebro11. Este protocolo combina um método de centrifugação de gradiente de densidade otimizado para tecidos adiposos por Rosen et al.12 com um passo de “limpeza” de núcleos com um Sorter de Alta Velocidade MoFlo XDP. Como visto nos resultados representativos, uma análise de 7.500 núcleos únicos do tecido adiposo marrom interscapular do rato identificou vários tipos de células dentro de adipócitos marrons aparentemente homogêneos. No geral, este protocolo simples e robusto pode ser aplicado para estudar a organização de nível tecidual de adipócitos e células residentes de adiposos, identificação de genes marcadores específicos do subtipo e fenotipagem de desenvolvimento de camundongos eliminatórios/transgênicos adiposos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Um método simples e robusto para isolar núcleos únicos e estudar a heterogeneidade do tecido adiposo é apresentado. Comparado ao sequenciamento de RNA de tecido inteiro, este fluxo de trabalho oferece uma visão imparcial da heterogeneidade celular e marcadores específicos da população. Isso é significativo e inovador para o avanço da biologia adipócito, metabolismo molecular e pesquisa sobre obesidade.
Este protocolo é particularmente otimizado para a aplicação a jusante de snRNA…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer a David Reynolds do núcleo de Genômica Albert Einstein e Jinghang Zhang do Núcleo de Citometria de Fluxo pelo apoio técnico. Reconhecemos o apoio dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) (DK110426) e do Pilot and Feasibility Grants do Einstein-Mount Sinai Diabetes Research Center (DK020541) e do New York Obesity Research Center (DK026687) (todos para K.S.). Também gostaríamos de agradecer ao Albert Einstein Cancer Center (CA013330) pelo apoio do núcleo.
Materials
| autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | PBS with EDTA; sterile-filtered |
| BSA | Sigma | A1595 | |
| CaCl2 | Sigma | 21115 | |
| Cell filter 100 μm | Corning | 431752 | |
| Cell filter 40μm | Corning | 431750 | |
| CellTrics (30 μm) | Sysmex | 04-004-2326 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF1000 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KCl | Fisher | P217-3 | |
| MACS SmartStrainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | Stackable filters |
| MgCl2 | Sigma | M1028 | |
| MoFloXDP Cell Sorter | Beckman Coulter | ML99030 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| Protector RNase Inhibitor | Roche | 3335402001 | |
| Sucrose | Fisher | S5-3 |
Referências
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