Isolering av fettvävnadskärnor för encelliga genomiska tillämpningar
Summary
Denna publikation beskriver ett protokoll för isolering av kärnor från mogna adipocyter, rening genom fluorescensaktiverad sortering och encellig transkriptomik.
Abstract
Brunt och beige fett är specialiserade fettvävnader som avleder energi för thermogenesis av UCP1 (Uncoupling Protein-1)-beroende och oberoende vägar. Tills nyligen ansågs termogena adipocyter vara en homogen population. Nyligen genomförda studier har dock visat att det finns flera subtyper eller subpopulationer som är distinkta i utvecklingsmässiga ursprung, substrat användning och transkriptom. Trots framsteg inom encellig genomik, opartisk nedbrytning av fettvävnader i cellulära subtyper har varit utmanande på grund av den bräckliga karaktären av lipidfyllda adipocyter. Protokollet som lagts fram utvecklades för att kringgå dessa hinder genom effektiv isolering av enskilda kärnor från fettvävnad för nedströms applikationer, inklusive RNA sekvensering. Cellulär heterogenitet kan sedan analyseras genom RNA-sekvensering och bioinformatiska analyser.
Introduction
Studier har visat att brun fettvävnad (BAT) har en anmärkningsvärd förmåga att avleda energi. Två typer av termogena adipocyter med distinkta utvecklingsmässiga funktioner finns i både gnagare och människor: beige adipocyter och klassiska bruna adipocyter. Medan klassiska bruna adipocyter ligger mestadels i interscapular BAT depåer, beige adipocyter sporadiskt dyka upp i vit fettvävnad (WAT) som svar på vissa fysiologiska ledtrådar, såsom kronisk kall exponering, en process som kallas “browning” eller “beiging”. Genom användning av avancerad avbildning, är det nu klart att vuxna människor har betydande depåer av UCP1+ BAT, särskilt i supraclavicular regionen1,2,3,4. Mängden vuxna mänskliga BAT omvänt korrelerar med adipositet och kan ökas med externa signaler, såsom kronisk kall exponering5,,6 eller β3-adrenerga receptor agonist7. BAT-medierad energiförbrukning kan erbjuda en hållbar strategi för att bekämpa fetma.
Tills nyligen har termogena adipocyter ansetts vara en homogen population. Studier har dock visat att det finns flera subtyper eller subpopulationer som är distinkta i utvecklingsursprung, substratanvändning och transkriptom8,9,10. Till exempel, en typ av beige adipocyte som företrädesvis använder glukos för thermogenesis, g-beige adipocyte, beskrevs nyligen10. Den ofullständiga förståelsen av celltyper i brun och beige fettvävnad och bristen på specifika markörer utgör ett kritiskt hinder för att studera deras biologiska funktioner.
Traditionella metoder för att isolera subpopulationer av celler är baserade på uttryck av endast ett fåtal kända markörgener. Den senaste tidens framsteg inom encellig genomik gör det möjligt att använda globala genuttrycksdata för enskilda celler för att ge en opartisk uppskattning av antalet subpopulationer i en vävnad. Det slutliga målet med detta protokoll är att bestämma alla fettvävnad subtyper under olika termogena stimuli vid en enda cell upplösning. I motsats till andra vävnader och celltyper, bestämma cellulära subtyper av fettvävnad är utmanande på grund av bräcklighet lipidfyllda adipocyter. Detta dokument introducerar ett robust protokoll för att isolera enstaka kärnor från fettvävnad för nedströms ansökan till snRNA sekvensering. Viktigt, senaste litteraturen jämföra väl matchade single-nuclei RNA sekvensering (snRNA-seq) och encellig RNA sekvensering (scRNA-seq) datamängder visade att snRNA-seq är jämförbar med scRNA-seq i celltyp upptäckt, och överlägsen i cellulär täckning för en komplex vävnad som hjärnan11. Detta protokoll kombinerar en densitet gradient centrifugering metod optimerad för fettvävnader av Rosen et al.12 med en kärnor “sanering” steg med en MoFlo XDP High Speed Sorter. Som framgår av de representativa resultaten, en analys av 7.500 enda kärnor från musen interscapular brun fettvävnad identifierade flera celltyper inom till synes homogena bruna adipocyter. Sammantaget kan detta enkla och robusta protokoll tillämpas för att studera vävnadsnivå organisation av adipocyter och fett-bosatta celler, identifiering av subtyp-specifika markör gener och utveckling fenotypning av fett-selektiv knockout/transgena möss.
Protocol
Representative Results
Discussion
En enkel och robust metod för att isolera enstaka kärnor och studera fettvävnad heterogenitet presenteras. Jämfört med hela vävnad RNA sekvensering, erbjuder detta arbetsflöde en opartisk bild av cellulära heterogenitet och populationsspecifika markörer. Detta är betydande och innovativt för utvecklingen av adipocytebiologi, molekylär metabolism och fetmaforskning.
Detta protokoll är särskilt optimerat för nedströms tillämpning av snRNA-seq. “Rensning” steg för att uppnå iso…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka David Reynolds från Albert Einstein Genomics kärna och Jinghang Zhang från Flow Cytometry Core för teknisk support. Vi bekräftar stöd från National Institutes of Health (NIH) (DK110426) och Pilot och bidrag genomförbarhet från Einstein-Mount Sinai Diabetes Research Center (DK020541), och New York Fetma Research Center (DK026687) (allt till KS). Vi vill också tacka Albert Einstein Cancer Center (CA013330) för kärnstöd.
Materials
| autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | PBS with EDTA; sterile-filtered |
| BSA | Sigma | A1595 | |
| CaCl2 | Sigma | 21115 | |
| Cell filter 100 μm | Corning | 431752 | |
| Cell filter 40μm | Corning | 431750 | |
| CellTrics (30 μm) | Sysmex | 04-004-2326 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF1000 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KCl | Fisher | P217-3 | |
| MACS SmartStrainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | Stackable filters |
| MgCl2 | Sigma | M1028 | |
| MoFloXDP Cell Sorter | Beckman Coulter | ML99030 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| Protector RNase Inhibitor | Roche | 3335402001 | |
| Sucrose | Fisher | S5-3 |
Referências
- Cypess, A. M., et al. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1509-1517 (2009).
- van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. Cold-activated brown adipose tissue in healthy men. The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1500-1508 (2009).
- Virtanen, K. A., et al. Functional brown adipose tissue in healthy adults. The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1518-1525 (2009).
- Nedergaard, J., Bengtsson, T., Cannon, B. Unexpected evidence for active brown adipose tissue in adult humans. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 293 (2), E444-E452 (2007).
- Saito, M., et al. High incidence of metabolically active brown adipose tissue in healthy adult humans: effects of cold exposure and adiposity. Diabetes. 58 (7), 1526-1531 (2009).
- Yoneshiro, T., et al. Recruited brown adipose tissue as an antiobesity agent in humans. The Journal of Clinical Investigation. 123 (8), 3404-3408 (2013).
- Cypess, A. M., et al. Activation of human brown adipose tissue by a β3-adrenergic receptor agonist. Cell Metabolism. 21 (1), 33-38 (2015).
- Song, A., et al. Low- and high-thermogenic brown adipocyte subpopulations coexist in murine adipose tissue. The Journal of Clinical Investigation. 130 (1), 247-257 (2020).
- Cinti, S., et al. CL316,243 and cold stress induce heterogeneous expression of UCP1 mRNA and protein in rodent brown adipocytes. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 50 (1), 21-31 (2002).
- Chen, Y., et al. Thermal stress induces glycolytic beige fat formation via a myogenic state. Nature. 565 (7738), 180-185 (2019).
- Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. PloS One. 13 (12), e0209648 (2018).
- Roh, H. C., et al. Simultaneous Transcriptional and Epigenomic Profiling from Specific Cell Types within Heterogeneous Tissues In Vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
- Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).
- Zheng, G. X. Y., et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nature Communications. 8, 14049 (2017).
- Pollen, A. A., et al. Low-coverage single-cell mRNA sequencing reveals cellular heterogeneity and activated signaling pathways in developing cerebral cortex. Nature Biotechnology. 32 (10), 1053-1058 (2014).
- Hayashi, T., et al. Single-cell full-length total RNA sequencing uncovers dynamics of recursive splicing and enhancer RNAs. Nature Communications. 9 (1), 619 (2018).
- Satpathy, A. T., et al. Massively parallel single-cell chromatin landscapes of human immune cell development and intratumoral T cell exhaustion. Nature Biotechnology. 37 (8), 925-936 (2019).
- Stoeckius, M., et al. Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells. Nature Methods. 14 (9), 865-868 (2017).
- Peterson, V. M., et al. Multiplexed quantification of proteins and transcripts in single cells. Nature Biotechnology. 35 (10), 936-939 (2017).
- Gaublomme, J. T., et al. Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics. Nature Communications. 10 (1), 2907 (2019).
