Blast Wave-model met lage intensiteit voor preklinische beoordeling van licht traumatisch hersenletsel met gesloten hoofd bij knaagdieren

Summary

We presenteren hier een protocol van een explosiegolfmodel voor knaagdieren om neurobiologische en pathofysiologische effecten van mild tot matig traumatisch hersenletsel te onderzoeken. We hebben een gasgestuurde, bench-top opstelling opgezet die is uitgerust met druksensoren die een betrouwbare en reproduceerbare generatie van door ontploffing geïnduceerd mild tot matig traumatisch hersenletsel mogelijk maken.

Abstract

Traumatisch hersenletsel (TBI) is een grootschalig probleem voor de volksgezondheid. Milde TBI is de meest voorkomende vorm van neurotrauma en is goed voor een groot aantal medische bezoeken in de Verenigde Staten. Er zijn momenteel geen door de FDA goedgekeurde behandelingen beschikbaar voor TBI. De toegenomen incidentie van militair gerelateerde, door ontploffingen geïnduceerde TBI accentueert de dringende behoefte aan effectieve TBI-behandelingen verder. Daarom zullen nieuwe preklinische TBI-diermodellen die aspecten van human blast-gerelateerde TBI samenvatten, de onderzoeksinspanningen naar de neurobiologische en pathofysiologische processen die ten grondslag liggen aan milde tot matige TBI aanzienlijk bevorderen, evenals de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën voor TBI.

Hier presenteren we een betrouwbaar, reproduceerbaar model voor het onderzoek naar de moleculaire, cellulaire en gedragseffecten van milde tot matige blast-geïnduceerde TBI. We beschrijven een stapsgewijs protocol voor gesloten hoofd, blast-geïnduceerde milde TBI bij knaagdieren met behulp van een bench-top opstelling bestaande uit een gasaangedreven schokbuis uitgerust met piëzo-elektrische druksensoren om consistente testomstandigheden te garanderen. De voordelen van de installatie die we hebben vastgesteld, zijn de relatief lage kosten, het installatiegemak, het gebruiksgemak en de hoge doorvoercapaciteit. Verdere voordelen van dit niet-invasieve TBI-model zijn de schaalbaarheid van de blast peak overdruk en het genereren van gecontroleerde reproduceerbare uitkomsten. De reproduceerbaarheid en relevantie van dit TBI-model is geëvalueerd in een aantal downstream-toepassingen, waaronder neurobiologische, neuropathologische, neurofysiologische en gedragsanalyses, ter ondersteuning van het gebruik van dit model voor de karakterisering van processen die ten grondslag liggen aan de etiologie van milde tot matige TBI.

Introduction

Traumatisch hersenletsel (TBI) is goed voor meer dan twee miljoen ziekenhuisbezoeken per jaar in de Verenigde Staten alleen. Milde TBI vaak als gevolg van auto-ongelukken, sportevenementen of vallen vertegenwoordigen ongeveer 80% van alle TBI-gevallen1. Milde TBI wordt beschouwd als de ‘stille ziekte’ omdat patiënten vaak geen openlijke symptomen ervaren in de dagen en maanden na de eerste belediging, maar later in het leven ernstige TBI-gerelateerde complicaties kunnen ^ontwikkelen2. Bovendien komt blast-geïnduceerde milde TBI veel voor bij leden van de militaire dienst en is het in verband gebracht met chronische CZS-disfunctie3,4,5,6. Vanwege de stijgende incidentie van blastaire milde ^TBI7,8 is preklinische modellering van neurobiologische en pathofysiologische processen geassocieerd met milde TBI dus een focus geworden in de ontwikkeling van nieuwe therapeutische interventies voor TBI.

Historisch gezien heeft TBI-onderzoek zich voornamelijk gericht op ernstige vormen van neurotrauma, ondanks het relatief lagere aantal ernstige menselijke TBI-gevallen. Preklinische knaagdiermodellen voor ernstige menselijke TBI zijn ontwikkeld, waaronder de controlled cortical impact (CCI)^9,10 en fluid percussion injury (FPI)¹¹ modellen, die beide goed ingeburgerd zijn om betrouwbare pathofysiologische effecten te ^{produceren12,13}. Deze modellen hebben de basis gelegd voor wat vandaag bekend is over neuro-inflammatie, neurodegeneratie en neuronale reparatie in TBI. Hoewel er aanzienlijke kennis van de pathofysiologie van TBI is ontwikkeld, zijn er momenteel geen effectieve, door de FDA goedgekeurde behandelingen beschikbaar voor TBI.

Meer recent is de focus van TBI-onderzoek verbreed naar een breder spectrum van TBI-gerelateerde pathologieën met als uiteindelijk doel effectieve therapeutische interventies te ontwikkelen. Niettemin zijn er weinig preklinische modellen voor milde TBI vastgesteld die meetbare effecten hebben aangetoond, en slechts een klein aantal studies heeft het milde TBI-spectrum2,14,15 onderzocht. Aangezien milde TBI verantwoordelijk is voor de grote meerderheid van alle TBI-gevallen, zijn betrouwbare modellen van milde TBI dringend nodig om onderzoek naar de etiologie en neuropathofysiologie van de menselijke conditie te vergemakkelijken, om nieuwe therapeutische strategieën te ontwikkelen.

In samenwerking met biomedische ingenieurs en lucht- en ruimtevaartfysici hebben we een schaalbaar, gesloten-head blast wave-model opgezet voor milde tot matige TBI. Dit preklinische knaagdiermodel is speciaal ontwikkeld om de effecten van krachtdynamiek te onderzoeken, waaronder explosiegolven en versnellings- / vertragingsbewegingen, die geassocieerd zijn met menselijke milde TBI verkregen in militaire gevechten, sportevenementen, auto-ongelukken en vallen. Omdat explosiegolven correleren met de krachtdynamiek die milde TBI bij mensen veroorzaakt, is dit model ontworpen om een consistente Friedlander-golfvorm te produceren met een impuls, die wordt gemeten als ponden per vierkante inch (psi) * milliseconde (ms). Het impulsniveau wordt geschaald om onder de gedefinieerde longhindercurven voor muizen en ratten te vallen om preklinisch onderzoek uit te voeren16,17,18. Bovendien maakt dit model onderzoek mogelijk naar coup- en contrecoup-letsel als gevolg van snelle rotatiekrachten van het hoofd van het dier. Dit soort letsel is inherent aan verschillende soorten klinische TBI-presentaties, waaronder die waargenomen bij zowel militaire als civiele populaties. Daarom past dit veelzijdige model in een behoefte die meerdere klinische presentaties van TBI omvat.

Het hier gepresenteerde preklinische model produceert betrouwbare en reproduceerbare pathofysiologische veranderingen geassocieerd met klinisch milde TBI zoals aangetoond door een aantal eerdere studies17,19,20,21,22,23. Studies met dit model toonden aan dat ratten die werden onderworpen aan een ontploffingsgolf met lage intensiteit neuro-inflammatie, axonaal letsel, microvasculaire schade, biochemische veranderingen gerelateerd aan neuronale schade en tekorten in plasticiteit op korte termijn en synaptische prikkelbaarheid ^vertoonden19. Dit milde TBI-model induceerde echter geen macroscopische neuropathologische veranderingen, waaronder weefselbeschadiging, bloeding, hematoom en ^kneuzing19 die vaak zijn waargenomen in studies met matige tot ernstige invasieve ^{TBI-modellen10,24}. Eerder onderzoek19,21,22,23 heeft aangetoond dat dit preklinische model kan worden gebruikt om neurobiologische en pathofysiologische processen te karakteriseren die ten grondslag liggen aan de etiologie van milde pt matige TBI17,19,20,21,22,23. Dit model maakt het ook mogelijk om nieuwe therapeutische verbindingen en strategieën te testen, evenals de identificatie van nieuwe, geschikte doelen voor de ontwikkeling van effectieve TBI-interventies19,21,22,23.

Dit model is ontwikkeld om effecten te onderzoeken die worden veroorzaakt door explosiegolven en snelle rotatiekrachten op moleculaire, cellulaire en gedragsmatige uitkomsten bij knaagdieren. Analoog aan het hier gepresenteerde explosiegolfmodel is een aantal preklinische modellen ontwikkeld die proberen milde tot matige TBI samen te vatten met behulp van gasgestuurde overdrukgolven2,14,17,25,26,27,28. Enkele van de beperkingen van andere modellen zijn: het dier is bevestigd aan een gaasgurney en het hoofd wordt geïmmobiliseerd bij impact; de perifere organen worden naast de hersenen blootgesteld aan de golf, waardoor de verstorende variabelen van polytrauma ontstaan; en de modellen zijn groot en stationair, wat het veranderen en aanpassen van kritische parameters beperkt tot betere modelomstandigheden die doen denken aan menselijke TBI.

De voordelen van deze bench-top, gasgestuurde schokbuisopstelling zijn de relatief lage kosten voor aanschaf- en bedrijfskosten, evenals het gemak van installatie en gebruik. Bovendien maakt de opstelling een hoge doorvoer en het genereren van gecontroleerde reproduceerbare explosiegolven en in vivo resultaten bij zowel muizen als ratten mogelijk. Om te kunnen controleren op consistente testomstandigheden (d.w.z. constante straalgolf en overdruk) is de opstelling uitgerust met druksensoren. De voordelen van dit model voor TBI zijn onder meer de schaalbaarheid van de ernst van het letsel en dat milde TBI wordt geïnduceerd met behulp van een niet-invasieve, gesloten hoofdprocedure. Piekoverdruk en daaropvolgende hersenletsel nemen toe met dikkere polyester membranen op een consistente schaalbare ^manier17. De mogelijkheid om de ernst van TBI te schalen door middel van membraandikte is een nuttig hulpmiddel om het niveau te bepalen waarop specifieke uitkomstmaten (bijv. Neuro-inflammatie) duidelijk worden. Het bieden van beschermende afscherming voor de perifere organen maakt ook gericht onderzoek naar milde TBI-mechanismen mogelijk door verstorende variabelen van systemisch letsel, zoals long- of thoracale schade, te vermijden of te verminderen. Bovendien maakt deze opstelling het mogelijk om de richting te selecteren, waardoor de ontploffingsgolf het hoofd raakt / binnendringt (d.w.z. frontaal, zijkant, boven of onder) en daarom kunnen verschillende soorten TBI-inducerende beledigingen worden onderzocht. De hier beschreven standaardprocedure voor het induceren van milde tot matige TBI maakt gebruik van zijdelingse blootstelling om de effecten van explosiegolfletsel in combinatie met coup- en contrecoupletsel als gevolg van snelle rotatiekrachten te evalueren. Bovendien kan, om uitsluitend door explosie geïnduceerd letsel te onderzoeken, top-down explosiegolfblootstelling worden gebruikt in dit model.

Protocol

Het protocol volgt de richtlijnen voor dierverzorging van de Universiteit van Cincinnati en de West Virginia University. Alle procedures met betrekking tot dieren werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committees (IACUC) en werden uitgevoerd volgens de principes van de Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. 1. Installatie van de blast TBI setup Verkrijg alle werkende onderdelen die nodig zijn voor de installatie, waaronder: schokbuis…

Representative Results

De schaalbaarheid van de blast wave setup werd getest met behulp van drie verschillende membraandiktes, 25,4, 50,8 en 76,2 μm. Piekdrukniveaus werden beoordeeld op het hoofdplaatsingsgebied en de uitgang van het schokbuisapparaat met behulp van piëzo-elektrische druksensoren (zie figuur 1 en figuur 2). Piekdrukken nemen toe in overeenstemming met de membraandikte op beide sensorlocaties (figuur 3A,B), wat aantoont…

Discussion

We presenteren hier een preklinisch mild TBI-model dat kosteneffectief is, eenvoudig in te stellen en uit te voeren, en zorgt voor high-throughput, betrouwbare en reproduceerbare experimentele resultaten. Dit model biedt beschermende afscherming aan perifere organen om gericht onderzoek naar milde TBI-mechanismen mogelijk te maken en tegelijkertijd de verstorende variabelen van systemisch letsel te beperken. Van andere blastaire modellen is daarentegen bekend dat ze schade toebrengen aan perifere organen2,39,40.<sup clas…

Materials

3/8 SAE High Pressure Hydraulic Hose	Eaton Aeroquip	R2-6-6-36M	Available from Grainger
3/8'' Quick Connect Female Plugs	Karcher	KAR 86410440
3/8'' Quick Connect Male Plugs	Karcher	KAR 86410440
ANY-maze video tracking software	Stoelting Co.	ANY-maze software
Clear Mylar membrane	ePlastics.com	POLYCLR0.003	http://www.eplastics.com/Plastic/Clear_Polyester_Film/POLYCLR0-003; Clear Mylar membrane is sold in various thicknesses. All are sold by vendor listed above.
Compound Slide Table (X2)	Grizzly Industrial	G5757
Deadman Gas Control Ball Valve	Coneraco Inc.	71-502-01	"Apollo", Available from Grainger
Driver and driven section (murine)	own design/production	n/a	For further information please contact the authors
Driver and driven section (rat)	own design/production	n/a	For further information please contact the authors
Ear Muffs	3M	37274	Available from Grainger
Gas Regulator – Hi Flow 3500-600-580	Harris	3003539
Helium Gas	AirGas	HE 300	Tanks are available in various sizes
Inhalation Anesthesia System	VetEquip	901806
Input Module	National Instruments	NI 9223
Isoflurane	Baxter	NDC 10019-360-40	Ordered by veterinarian
Laboratory Timer/Stopwatch	Fisher Scientific	50-550-352
Labview version 12.0	National Instruments		Data Acquistion Software
Magnetic Dial Indicator/Micrometer	Grizzly Industrial	G9849
MATLAB	MathWorks		Software for pressure recording analysis
Oxygen Regulator	Medline	HCS8725M
PC for Data Processing	Dell
Polyvinylchloride Tubing – 25.4 mm	FORMUFIT	P001FGP-WH-40×3
Pressure sensors	PCB Piezotronics	102A05
Receiver USB Chassis	National Instruments	DAQ-9171
Sensor Signal Conditioner	PCB Piezotronics	482C series
Stainless NSF-Rated Mounting Table	Gridmann	GR06-WT2448
T Handle Allen Wrench – 3/16''	S&K	73310