Modelo de onda de explosão de baixa intensidade para avaliação pré-clínica de lesão cerebral traumática leve de cabeça fechada em roedores

Summary

Apresentamos aqui um protocolo de um modelo de onda de explosão para roedores para investigar efeitos neurobiológicos e fisiodicos de lesão cerebral traumática leve a moderada. Estabelecemos uma configuração de banco-topo, movida a gás, equipada com sensores de pressão, permitindo uma geração confiável e reprodutível de lesão cerebral traumática leve a moderada induzida por explosão.

Abstract

Lesão cerebral traumática (TCE) é um problema de saúde pública em larga escala. O TBI leve é a forma mais prevalente de neurotrauma e é responsável por um grande número de consultas médicas nos Estados Unidos. Atualmente, não há tratamentos aprovados pela FDA disponíveis para TBI. O aumento da incidência de TBI relacionado a explosões e militares acentua ainda mais a necessidade urgente de tratamentos eficazes de TCE. Portanto, novos modelos de animais pré-clínicos de TCE que recapitulam aspectos do TBI relacionado à explosão humana avançarão muito os esforços de pesquisa nos processos neurobiológicos e fisioterapológicos subjacentes ao TBI leve a moderado, bem como o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para a TBI.

Aqui apresentamos um modelo confiável e reprodutível para a investigação dos efeitos moleculares, celulares e comportamentais de TBI leve a moderada induzida por explosão. Descrevemos um protocolo passo-a-passo para TBI leve de cabeça fechada e induzido por explosão em roedores usando uma configuração de bancada composta por um tubo de choque movido a gás equipado com sensores de pressão piezoelétricas para garantir condições de teste consistentes. Os benefícios da configuração que estabelecemos são seu relativo baixo custo, facilidade de instalação, facilidade de uso e capacidade de alta produtividade. Outras vantagens deste modelo TBI não invasivo incluem a escalabilidade da sobrepressão do pico da explosão e a geração de resultados reprodutíveis controlados. A reprodutibilidade e relevância deste modelo TBI tem sido avaliada em uma série de aplicações a jusante, incluindo análises neurobiológicas, neuropatológicas, neurofisiológicas e comportamentais, apoiando o uso desse modelo para a caracterização de processos subjacentes à etiologia de TCE leve a moderada.

Introduction

A lesão cerebral traumática (TCE) é responsável por mais de dois milhões de visitas hospitalares por ano apenas nos Estados Unidos. TBI leve comumente resultante de acidentes de carro, eventos esportivos ou quedas representam aproximadamente 80% de todos os casos de ^TCE1. O TBI leve é considerado a “doença silenciosa”, pois os pacientes muitas vezes não experimentam sintomas a ver com os dias e meses seguintes ao insulto inicial, mas podem desenvolver sérias complicações relacionadas ao TCE mais tarde na ^vida2. Além disso, o TCE leve induzido por explosão é prevalente entre os militares e tem sido associado à disfunção crônica do CNS3,4,5,6. Devido à crescente incidência de ^TBI7,8 leve relacionada à explosão, a modelagem pré-clínica dos processos neurobiológicos e fisiocessiológicos associados ao TCE leve tornou-se, assim, foco no desenvolvimento de novas intervenções terapêuticas para TCE.

Historicamente, a pesquisa da TBI tem se concentrado principalmente em formas graves de neurotrauma, apesar do número relativamente menor de casos graves de TCE humanos. Foram desenvolvidos modelos de roedores pré-clínicos para TBI humano severo, incluindo os modelos de impacto cortical controlado (CCI)^9,10 e lesão de percussão fluida (FPI)¹¹, ambos bem estabelecidos para produzir efeitos fisiodicos ^{confiáveis12,13}. Esses modelos estabeleceram as bases para o que se sabe hoje sobre neuroinflamação, neurodegeneração e reparação neuronal em TBI. Embora o conhecimento considerável da fisiopatologia do TCE tenha sido desenvolvido, atualmente não há tratamentos eficazes e aprovados pela FDA disponíveis para tce.

Mais recentemente, o foco da pesquisa de TCE foi ampliado para incluir um espectro mais amplo de patologias relacionadas ao TBI com o objetivo final de desenvolver intervenções terapêuticas eficazes. No entanto, foram estabelecidos poucos modelos pré-clínicos para TCE leve que mostraram efeitos mensuráveis, e apenas um pequeno número de estudos investigou o espectro TBI leve2,14,15. Como a URB leve é responsável pela grande maioria de todos os casos de TCE, modelos confiáveis de TCE leve são urgentemente necessários para facilitar a pesquisa sobre a etiologia e a neuropafiologia da condição humana, a fim de desenvolver novas estratégias terapêuticas.

Em conjunto com engenheiros biomédicos e físicos aeroespaciais, estabelecemos um modelo escalável de ondas de explosão de cabeça fechada para TBI leve a moderada. Este modelo de roedor pré-clínico foi desenvolvido especificamente para investigar os efeitos da dinâmica da força, incluindo ondas de explosão e movimento de aceleração/desaceleração, que estão associados ao TBI leve humano obtido em combate militar, eventos esportivos, acidentes de carro e quedas. À medida que as ondas de explosão se correlacionam com a dinâmica da força que causa tce-TBI leve em humanos, este modelo foi projetado para produzir uma forma de onda friedlander consistente com um impulso, que é medido como libras por polegada quadrada (psi)*milissegundo (ms). O nível de impulso é escalado para ficar abaixo das curvas de letalidade pulmonar definidas para ratos e ratos, a fim de realizar investigações pré-clínicas16,17,18. Além disso, este modelo permite a investigação de golpes e lesões contrecoup devido às rápidas forças rotacionais da cabeça do animal. Esse tipo de lesão é inerente a vários tipos de apresentações clínicas de TCE, incluindo aquelas observadas em populações militares e civis. Portanto, este modelo versátil se encaixa em uma necessidade que engloba múltiplas apresentações clínicas de TCE.

O modelo pré-clínico aqui apresentado produz alterações fisiopatológicas confiáveis e reprodutíveis associadas ao TCE clínico leve, como demonstrado por uma série de estudos anteriores17,19,20,21,22,23. Estudos com este modelo mostraram que ratos submetidos a uma onda de explosão de baixa intensidade apresentaram neuroinflamação, lesão axonal, dano microvascular, alterações bioquímicas relacionadas à lesão neuronal e déficits em plasticidade de curto prazo e excitabilidade ^sináptica19. No entanto, este modelo leve de TCE não induziu alterações neuropatológicas macroscópicas, incluindo danos teciduais, hemorragia, hematoma e ^contusão19 que têm sido comumente observados em estudos usando modelos de TCE invasivos moderados a ^graves10,24. Pesquisas anteriores19,21,22,23 mostraram que esse modelo pré-clínico pode ser usado para caracterizar processos neurobiológicos e fisioterápicos subjacentes à etiologia do TBI17,19,20,21,22,23. Este modelo também permite o teste de novos compostos e estratégias terapêuticas, bem como a identificação de novas metas adequadas para o desenvolvimento de intervenções eficazes do TCE19,21,22,23.

Este modelo foi desenvolvido para investigar efeitos induzidos por ondas de explosão, bem como forças rotacionais rápidas em resultados moleculares, celulares e comportamentais em roedores. Análogo ao modelo de onda de explosão apresentado aqui, vários modelos pré-clínicos foram desenvolvidos que tentam recapitular tbi leve a moderado usando ondas de sobrepressão movidas a gás2,14,17,25,26,27,28. Algumas das limitações de outros modelos incluem: o animal é fixado em uma maca de malha de arame e a cabeça é imobilizada após o impacto; os órgãos periféricos são expostos à onda, além do cérebro, o que cria as variáveis de confusão do politraumatismo; e os modelos são grandes e estacionários, o que limita a mudança e adaptação de parâmetros críticos a melhores condições de modelo que lembram o TBI humano.

Os benefícios desta configuração de tubo de choque movido a gás são seu custo relativo baixo para despesas de aquisição e execução, bem como facilidade de instalação e uso. Além disso, a configuração permite a operação de alto rendimento e geração de ondas de explosão reprodutíveis controladas e resultados in vivo em camundongos e ratos. A fim de controlar condições de teste consistentes (ou seja, onda de explosão constante e sobrepressão) a configuração é equipada com sensores de pressão. As vantagens deste modelo para TCE incluem a escalabilidade da gravidade da lesão e que o TCE leve é induzido por um procedimento não invasivo de cabeça fechada. O pico de sobrepressão e a lesão cerebral subsequente aumentam com membranas de poliéster mais espessas de forma escalável ^{consistente17}. A capacidade de escalar a gravidade do TCE através da espessura da membrana é uma ferramenta útil para determinar o nível, no qual medidas específicas de desfecho (por exemplo, neuroinflamação) tornam-se evidentes. Fornecendo blindagem protetora para os órgãos periféricos, também permite a investigação focada em mecanismos leves de TCE, evitando ou reduzindo variáveis de confusão de lesões sistêmicas, como lesão pulmonar ou torácica. Além disso, essa configuração permite selecionar a direção, pela qual a onda de explosão atinge/penetra a cabeça (ou seja, frente a frente, lado, superior ou inferior) e, portanto, diferentes tipos de insultos indutores de TBI podem ser investigados. O procedimento padrão para induzir TBI leve a moderada descrito aqui emprega exposição lateral para avaliar os efeitos da lesão de onda de explosão em combinação com lesão de golpe e contrecoup devido a forças rotacionais rápidas. Além disso, a fim de investigar exclusivamente lesões induzidas por explosão, a exposição de ondas de explosão de cima para baixo pode ser empregada neste modelo.

Protocol

O protocolo segue as diretrizes de cuidados com animais da Universidade de Cincinnati e da Universidade da Virgínia Ocidental. Todos os procedimentos envolvendo animais foram aprovados pelos Comitês Institucionais de Atenção e Uso de Animais (IACUC), e foram realizados de acordo com os princípios do Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. 1. Instalação da configuração de TBI de explosão Adquira todas as peças de trabalho necessárias para a conf…

Representative Results

A escalabilidade da configuração da onda de explosão foi testada usando três espessuras de membrana diferentes, 25,4, 50,8 e 76,2 μm. Os níveis de pressão máxima foram avaliados na área de colocação da cabeça e na saída do aparelho do tubo de choque usando sensores de pressão piezoelétrica (ver Figura 1 & Figura 2). As pressões máximas aumentam em concordância com a espessura da membrana em ambos os locais dos sensores (Fig…

Discussion

Apresentamos aqui um modelo de TCE leve pré-clínico que seja econômico, fácil de configurar e executar, e permite resultados experimentais de alta produtividade, confiáveis e reprodutíveis. Este modelo fornece proteção protetora aos órgãos periféricos para permitir uma investigação focada em mecanismos leves de TCE, limitando as variáveis de confusão da lesão sistêmica. Em contraste, outros modelos de explosão são conhecidos por infligir danos aos órgãos periféricos2,39,40.<s…

Materials

3/8 SAE High Pressure Hydraulic Hose	Eaton Aeroquip	R2-6-6-36M	Available from Grainger
3/8'' Quick Connect Female Plugs	Karcher	KAR 86410440
3/8'' Quick Connect Male Plugs	Karcher	KAR 86410440
ANY-maze video tracking software	Stoelting Co.	ANY-maze software
Clear Mylar membrane	ePlastics.com	POLYCLR0.003	http://www.eplastics.com/Plastic/Clear_Polyester_Film/POLYCLR0-003; Clear Mylar membrane is sold in various thicknesses. All are sold by vendor listed above.
Compound Slide Table (X2)	Grizzly Industrial	G5757
Deadman Gas Control Ball Valve	Coneraco Inc.	71-502-01	"Apollo", Available from Grainger
Driver and driven section (murine)	own design/production	n/a	For further information please contact the authors
Driver and driven section (rat)	own design/production	n/a	For further information please contact the authors
Ear Muffs	3M	37274	Available from Grainger
Gas Regulator – Hi Flow 3500-600-580	Harris	3003539
Helium Gas	AirGas	HE 300	Tanks are available in various sizes
Inhalation Anesthesia System	VetEquip	901806
Input Module	National Instruments	NI 9223
Isoflurane	Baxter	NDC 10019-360-40	Ordered by veterinarian
Laboratory Timer/Stopwatch	Fisher Scientific	50-550-352
Labview version 12.0	National Instruments		Data Acquistion Software
Magnetic Dial Indicator/Micrometer	Grizzly Industrial	G9849
MATLAB	MathWorks		Software for pressure recording analysis
Oxygen Regulator	Medline	HCS8725M
PC for Data Processing	Dell
Polyvinylchloride Tubing – 25.4 mm	FORMUFIT	P001FGP-WH-40×3
Pressure sensors	PCB Piezotronics	102A05
Receiver USB Chassis	National Instruments	DAQ-9171
Sensor Signal Conditioner	PCB Piezotronics	482C series
Stainless NSF-Rated Mounting Table	Gridmann	GR06-WT2448
T Handle Allen Wrench – 3/16''	S&K	73310