Modelo de onda blástica de baja intensidad para la evaluación preclínica de la lesión cerebral traumática leve de cabeza cerrada en roedores

Summary

Presentamos aquí un protocolo de un modelo de onda expansiva para roedores para investigar los efectos neurobiológicos y fisiopatológicos de la lesión cerebral traumática leve a moderada. Establecimos una configuración de sobremesa impulsada por gas equipada con sensores de presión que permiten una generación confiable y reproducible de lesiones cerebrales traumáticas leves a moderadas inducidas por explosiones.

Abstract

La lesión cerebral traumática (LCT) es un problema de salud pública a gran escala. La LCT leve es la forma más frecuente de neurotrauma y representa un gran número de visitas médicas en los Estados Unidos. Actualmente no hay tratamientos aprobados por la FDA disponibles para TBI. El aumento de la incidencia de LCT inducida por explosiones relacionada con el ejército acentúa aún más la necesidad urgente de tratamientos efectivos contra la LCT. Por lo tanto, los nuevos modelos animales preclínicos de LCT que recapitulan aspectos de la LCT humana relacionada con los blastos avanzarán en gran medida en los esfuerzos de investigación sobre los procesos neurobiológicos y fisiopatológicos subyacentes a la LCT leve a moderada, así como el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas para la LCT.

Aquí presentamos un modelo confiable y reproducible para la investigación de los efectos moleculares, celulares y conductuales de una LCT inducida por explosión leve a moderada. Describimos un protocolo paso a paso para una LCT leve inducida por explosión de cabeza cerrada en roedores utilizando una configuración de sobremesa que consiste en un tubo de choque impulsado por gas equipado con sensores de presión piezoeléctricos para garantizar condiciones de prueba consistentes. Los beneficios de la configuración que hemos establecido son su bajo costo relativo, facilidad de instalación, facilidad de uso y capacidad de alto rendimiento. Otras ventajas de este modelo de LCT no invasiva incluyen la escalabilidad de la sobrepresión del pico de explosión y la generación de resultados reproducibles controlados. La reproducibilidad y relevancia de este modelo de LCT se ha evaluado en una serie de aplicaciones posteriores, incluidos los análisis neurobiológicos, neuropatológicos, neurofisiológicos y conductuales, lo que respalda el uso de este modelo para la caracterización de los procesos subyacentes a la etiología de un TCE leve a moderado.

Introduction

La lesión cerebral traumática (LCT) representa más de dos millones de visitas al hospital cada año solo en los Estados Unidos. La LCT leve comúnmente resultante de accidentes automovilísticos, eventos deportivos o caídas representa aproximadamente el 80% de todos los casos de ^LCT1. La LCT leve se considera la “enfermedad silenciosa”, ya que los pacientes a menudo no experimentan síntomas manifiestos en los días y meses posteriores a la lesión inicial, pero pueden desarrollar complicaciones graves relacionadas con la LCT más adelante en la ^vida2. Además, el TCE leve inducido por explosiones es prevalente entre los miembros del servicio militar, y se ha asociado con disfunción crónica del SNC3,4,5,6. Debido a la creciente incidencia de LCT leve relacionada con ^{blastocitos7,8}, la modelización preclínica de los procesos neurobiológicos y fisiopatológicos asociados con LCT leve se ha convertido así en un foco en el desarrollo de nuevas intervenciones terapéuticas para LCT.

Históricamente, la investigación de LCT se ha centrado principalmente en las formas graves de neurotrauma, a pesar del número relativamente menor de casos graves de LCT humana. Se han desarrollado modelos preclínicos de roedores para LCT humana grave, incluyendo los modelos de impacto cortical controlado (ICC)^9,10 y lesión por percusión fluida (FPI)¹¹, ambos bien establecidos para producir efectos fisiopatológicos ^fiables12,13. Estos modelos han sentado las bases para lo que se conoce hoy en día sobre la neuroinflamación, la neurodegeneración y la reparación neuronal en TBI. Aunque se ha desarrollado un conocimiento considerable de la fisiopatología de la LCT, actualmente no hay tratamientos efectivos aprobados por la FDA disponibles para la LCT.

Más recientemente, el enfoque de la investigación de LCT se ha ampliado para incluir un espectro más amplio de patologías relacionadas con LCT con el objetivo final de desarrollar intervenciones terapéuticas efectivas. Sin embargo, se han establecido pocos modelos preclínicos para LCT leve que hayan mostrado efectos medibles, y sólo un pequeño número de estudios han investigado el espectro de LCT leve2,14,15. Dado que la LCT leve representa la gran mayoría de todos los casos de LCT, se necesitan urgentemente modelos fiables de LCT leve para facilitar la investigación sobre la etiología y la neuropatofisiología de la condición humana, con el fin de desarrollar nuevas estrategias terapéuticas.

Junto con ingenieros biomédicos y físicos aeroespaciales, hemos establecido un modelo escalable de onda expansiva de cabeza cerrada para una LCT leve a moderada. Este modelo preclínico de roedores se ha desarrollado específicamente para investigar los efectos de la dinámica de la fuerza, incluidas las ondas expansivas y el movimiento de aceleración / desaceleración, que se asocian con una LCT leve humana obtenida en combate militar, eventos deportivos, accidentes automovilísticos y caídas. Como las ondas expansivas se correlacionan con la dinámica de fuerza que causa una lesión cerebral traumática leve en humanos, este modelo fue diseñado para producir una forma de onda de Friedlander consistente con un impulso, que se mide como libras por pulgada cuadrada (psi) * milisegundo (ms). El nivel de impulso se escala para caer por debajo de las curvas de letalidad pulmonar definidas para ratones y ratas con el fin de realizar investigaciones preclínicas16,17,18. Además, este modelo permite la investigación de lesiones por golpes y contrecoup debido a las rápidas fuerzas de rotación de la cabeza del animal. Este tipo de lesión es inherente a varios tipos de presentaciones clínicas de LCT, incluidas las observadas tanto en poblaciones militares como civiles. Por lo tanto, este modelo versátil se ajusta a una necesidad que abarca múltiples presentaciones clínicas de TBI.

El modelo preclínico aquí presentado produce cambios fisiopatológicos fiables y reproducibles asociados a una lesión cerebral traumática leve clínica, como lo demuestran varios estudios previos17,19,20,21,22,23. Los estudios con este modelo mostraron que las ratas sometidas a una onda expansiva de baja intensidad exhibieron neuroinflamación, lesión axonal, daño microvascular, cambios bioquímicos relacionados con la lesión neuronal y déficits en la plasticidad a corto plazo y la excitabilidad sináptica19. Sin embargo, este modelo de LCT leve no indujo ningún cambio neuropatológico macroscópico, incluyendo daño tisular, hemorragia, hematoma y ^contusión19 que se han observado comúnmente en estudios con modelos de LCT invasivos moderados a ^severos10,24. Investigaciones anteriores19,21,22,23 han demostrado que este modelo preclínico puede ser utilizado para caracterizar los procesos neurobiológicos y fisiopatológicos subyacentes a la etiología del TBI leve y moderado17,19,20,21,22,23. Este modelo también permite probar nuevos compuestos y estrategias terapéuticas, así como la identificación de dianas novedosas y adecuadas para el desarrollo de intervenciones efectivas de LCT19,21,22,23.

Este modelo fue desarrollado para investigar los efectos inducidos por las ondas expansivas, así como las fuerzas de rotación rápidas en los resultados moleculares, celulares y de comportamiento en roedores. Análogamente al modelo de onda expansiva presentado aquí, se han desarrollado una serie de modelos preclínicos que intentan recapitular LCT leve a moderada utilizando ondas de sobrepresión impulsadas por gas2,14,17,25,26,27,28. Algunas de las limitaciones de otros modelos incluyen: el animal se fija a una camilla de malla de alambre y la cabeza se inmoviliza al impactar; los órganos periféricos están expuestos a la onda además del cerebro, lo que crea las variables de confusión del politraumatismo; y los modelos son grandes y estacionarios, lo que limita el cambio y la adaptación de parámetros críticos a mejores condiciones del modelo que recuerdan a la LCT humana.

Los beneficios de esta configuración de tubo de choque accionada por gas de sobremesa son su costo relativamente bajo para los gastos de adquisición y funcionamiento, así como la facilidad de instalación y uso. Además, la configuración permite una operación de alto rendimiento y la generación de ondas expansivas reproducibles controladas y resultados in vivo tanto en ratones como en ratas. Con el fin de controlar las condiciones de prueba consistentes (es decir, ondas de explosión constantes y sobrepresión), la configuración está equipada con sensores de presión. Las ventajas de este modelo para TBI incluyen la escalabilidad de la gravedad de la lesión y que la TBI leve se induce utilizando un procedimiento no invasivo de cabeza cerrada. La sobrepresión máxima y la posterior lesión cerebral aumentan con membranas de poliéster más gruesas de una manera escalable ^{consistente17}. La capacidad de escalar la gravedad de la LCT a través del grosor de la membrana es una herramienta útil para determinar el nivel en el que se hacen evidentes las medidas de resultado específicas (por ejemplo, neuroinflamación). Proporcionar un blindaje protector para los órganos periféricos, también permite la investigación enfocada en los mecanismos leves de LCT al evitar o reducir las variables de confusión de la lesión sistémica, como la lesión pulmonar o torácica. Además, esta configuración permite seleccionar la dirección en la que la onda expansiva golpea / penetra en la cabeza (es decir, de frente, lateral, superior o inferior) y, por lo tanto, se pueden investigar diferentes tipos de insultos que inducen LCT. El procedimiento estándar para inducir una LCT leve a moderada descrita aquí emplea la exposición lateral para evaluar los efectos de la lesión por ondas expansivas en combinación con la lesión por golpe y contrecoup debido a las fuerzas de rotación rápidas. Además, para investigar exclusivamente las lesiones inducidas por explosiones, se puede emplear la exposición a ondas de explosión de arriba hacia abajo en este modelo.

Protocol

El protocolo sigue las pautas de cuidado animal de la Universidad de Cincinnati y la Universidad de Virginia Occidental. Todos los procedimientos que involucran animales fueron aprobados por los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales (IACUC), y se realizaron de acuerdo con los principios de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. 1. Instalación de la configuración de TBI de explosión Adquiera todas las piezas de trabajo que se re…

Representative Results

La escalabilidad de la configuración de onda expansiva se probó utilizando tres espesores de membrana diferentes, 25.4, 50.8 y 76.2 μm. Los niveles de presión máxima se evaluaron en el área de colocación de la cabeza y la salida del aparato del tubo de choque utilizando sensores de presión piezoeléctricos (ver Figura 1 y Figura 2). Las presiones máximas aumentan en concordancia con el espesor de la membrana en ambas ubicaciones del sensor (<strong clas…

Discussion

Presentamos aquí un modelo preclínico de LCT leve que es rentable, fácil de configurar y ejecutar, y permite resultados experimentales de alto rendimiento, confiables y reproducibles. Este modelo proporciona un blindaje protector a los órganos periféricos para permitir una investigación centrada en los mecanismos leves de LCT al tiempo que limita las variables de confusión de la lesión sistémica. Por el contrario, se sabe que otros modelos de blastocitos infligen daño a los órganos periféricos2,39,40.<sup cla…

Materials

3/8 SAE High Pressure Hydraulic Hose	Eaton Aeroquip	R2-6-6-36M	Available from Grainger
3/8'' Quick Connect Female Plugs	Karcher	KAR 86410440
3/8'' Quick Connect Male Plugs	Karcher	KAR 86410440
ANY-maze video tracking software	Stoelting Co.	ANY-maze software
Clear Mylar membrane	ePlastics.com	POLYCLR0.003	http://www.eplastics.com/Plastic/Clear_Polyester_Film/POLYCLR0-003; Clear Mylar membrane is sold in various thicknesses. All are sold by vendor listed above.
Compound Slide Table (X2)	Grizzly Industrial	G5757
Deadman Gas Control Ball Valve	Coneraco Inc.	71-502-01	"Apollo", Available from Grainger
Driver and driven section (murine)	own design/production	n/a	For further information please contact the authors
Driver and driven section (rat)	own design/production	n/a	For further information please contact the authors
Ear Muffs	3M	37274	Available from Grainger
Gas Regulator – Hi Flow 3500-600-580	Harris	3003539
Helium Gas	AirGas	HE 300	Tanks are available in various sizes
Inhalation Anesthesia System	VetEquip	901806
Input Module	National Instruments	NI 9223
Isoflurane	Baxter	NDC 10019-360-40	Ordered by veterinarian
Laboratory Timer/Stopwatch	Fisher Scientific	50-550-352
Labview version 12.0	National Instruments		Data Acquistion Software
Magnetic Dial Indicator/Micrometer	Grizzly Industrial	G9849
MATLAB	MathWorks		Software for pressure recording analysis
Oxygen Regulator	Medline	HCS8725M
PC for Data Processing	Dell
Polyvinylchloride Tubing – 25.4 mm	FORMUFIT	P001FGP-WH-40×3
Pressure sensors	PCB Piezotronics	102A05
Receiver USB Chassis	National Instruments	DAQ-9171
Sensor Signal Conditioner	PCB Piezotronics	482C series
Stainless NSF-Rated Mounting Table	Gridmann	GR06-WT2448
T Handle Allen Wrench – 3/16''	S&K	73310