細胞体カルシウム測定とカルシウムイメージング研究のための脳毛細血管培養

Summary

脳毛細血管のペリサイトは、血液脳関門の特性と血流の調節に不可欠なプレーヤーです。このプロトコルは、脳の毛細血管のペリサイトを、細胞型に関してどのように分離し、培養し、蛍光プローブを用いた細胞内カルシウムシグナル伝達の調査に適用できるかを説明する。

Abstract

血管細胞は、神経血管ユニット(NVU)として知られている構造で内皮細胞および占星細胞のエンドフィートに関連付けられている。脳毛細血管ペリサイト機能は完全には知られていない。ペリサイトは、毛細血管の発達、内皮バリアの圧迫性および経月活性の調節、毛細血管の調節、および特定の脳病理において重要な役割を果たすことが示唆されている。

ペリサイトは、脳のパレンチマのプロセスを視覚化するのが困難であり、NVUの他の細胞との近接性のために、無傷の脳で調査することは困難です。本プロトコルは、脳シグナル伝達および病理に関与するアゴニストの影響を調査することができるカルシウムイメージング研究における主要なウシ脳毛細血管の分離および培養法およびそれらの次の使用法を記述する。皮質毛細管フラグメントは培養フラスコの底部に付着させ、6日後に、内皮細胞および側皮細胞が毛細管断片から成長した。内皮細胞は、穏やかなトリプシン法によって除去され、そして、過菌体は、通過する前に5日間培養される。

孤立したペリサイトは96ウェル培養プレートに播種され、プレートリーダーのセットアップで細胞内カルシウムレベルの測定を可能にするためにカルシウムインジケータ色素(Fura-2アセトキシメチル(AM))をロードします。あるいは、ペリサイトはカバースリップに播種され、細胞室に取り付けられる。カルシウムインジケーター(Cal-520 AM)を使用した負荷に続いて、カルシウムライブイメージングは、励起波長488nm、発光波長510~520nmの共焦点顕微鏡を使用して行うことができます。

ここで説明する方法は、初代脳毛細血管の第1の測定を得るために使用され、PERicytesがATPを介して刺激され、インビトロで収縮できることを実証した。

Introduction

脳毛細血管のペリサイトは、内皮細胞およびアストロサイトと共に、NVU^1、2、3を構成する。毛細血管の構造基盤を形成する内皮細胞は、直径5~8μmの長い円筒状のチューブを形成します。内皮細胞は、散発的に周皮細胞で覆われ、アストロサイトからの突起に囲まれています。アストロサイトの端足。

脳の毛細血管に位置する血液脳関門(BBB)は、脳と血液の間の栄養素、ガス、廃棄物の交換の主要な場所です。BBBはまた、内因性および外因性神経毒から脳を保護し、多数の薬物化合物の送達のための障壁として機能します。バリア機能は、中枢神経系(CNS)医薬品を開発している製薬会社にとって、焦点領域であり、障害です。これは、培養4におけるNVUの細胞の調査に大きな関心を駆り^{立ててきた}。脳の占星細胞と内皮細胞は、培養され、多くの研究で特徴づけられてきたが、ペリサイト培養の研究とプロトコルはまばらである。

以前に公開されたプロトコルは、イムノパンニング^5、高グルコース培地^6、蛍光活性化細胞選別^7、密度勾配遠心分離^8、等のようなさまざまなアプローチを用いて、ある程度脳毛細血管系の培養物の生成を記述している。これらの方法は、ペリサイトの培養を得るのに十分に思えるが、一部は時間がかかり、コストが高く、そして得られるペリサイトは、9の^{ペリサイトを}分化解除できる培養通路の数のために理想的ではないかもしれない。さらに、インビトロシグナル伝達研究における培養されたペリサイトの可能性は、これまでかなり未踏であった。

本研究では、孤立した牛の脳毛細血管からのpericyte培養の生成と、その後の細胞内カルシウムの変化の測定およびイメージング研究のセットアップに焦点を当てています。皮質灰色物質からの毛細血管の分離(詳細についてはHelmsら¹⁰参照)と、内皮細胞またはグリア細胞を汚染することなく純粋な単一培養における回膜細胞の単離および培養について簡単に説明する。次に、96ウェルプレートにペリサイトを播種し、カルシウムプローブFura-2 AM用の負荷プロトコルを使用するプロトコルを提供します。最後に、顕微鏡培養チャンバーでリアルタイムの共焦点イメージングでペリサイトがどのように使用できるかを示し、そのためのプロトコルについて説明します。

Protocol

細胞培養用バッファーおよび溶液の調製 ヒト胎盤から5mgのコラーゲンIVを4°Cで一晩PBS50mLに溶解してコラーゲンストック液を調製する。 5 mLの部分にストック液をアリコートし、-20°Cで保存します。 フィブロネクチンの5 mgを一晩で5 mLの無菌水に溶解してフィブロネクチンストック溶液を調製する。フィブロネクチンの在庫は-20°Cで500μLのアリコートで保管してください。 解凍…

Representative Results

牛の脳毛細血管は新鮮な脳組織から隔離され、 図1 は数日にわたる毛細血管播種および細胞の成長とその後のpericytesの精製を提示する。毛細血管は1日目にフラスコに完全に付着し、2日目に内皮発芽が見えるようになりました(図1、2日目)。4日後、細胞の成長は非常に特徴的であり(図1、4a)、内皮細胞?…

Discussion

本研究では、牛の脳から原発性ペリサイトを分離する方法を発表した。記述されたプロトコルは、そうでなければアクセスできないセル型のカルチャを許可します。その後得られた細胞培養は、ほぼ均質な近母細胞集団であり、細胞の形態およびタンパク質発現¹²に基づく内皮細胞およびグリア細胞との汚染はほとんどまたはまったくなかった。さらに、意図した結果に応?…

Materials

ATP	Tocris	3245
Cal-520 AM	AAT Bioquest	21130
Cell incubator	Thermo Fisher
Centrifuge	Thermo Fisher	Heraeus Multifuge 3SR+	Standard large volume centrifuge for spinning down cells
Collagen IV	Sigma Aldrich	C5533
Confocal laser scanning microscope	Carl Zeiss	Zeiss LSM 510	Inverted microscope
Counting chamber	FastRead	102
Coverslip cell chamber	Airekacells	SC15022
Cremophor EL	Sigma Aldrich	C5135	Formerly known as Kolliphor EL
DMSO	Sigma Aldrich	471267
Dulbecco's Modified Eagles Medium	Sigma Aldrich	D0819
Fetal bovine serum (FBS)	PAA/GE Healthcare	A15-101
Fibronectin	Sigma Aldrich	F1141
Fura-2 AM	Thermo Fisher	F1201
Glass coverslips 22×22 mm	VWR International	631-0123
HBSS	Gibco	14065-049
Heparin	Sigma Aldrich	H3149
HEPES	AppliChem Panreac	A1069
Light microscope	Olympus	Olympus CK2	Upright light microscope with phase contrast
MEM nonessential amino acids	Sigma Aldrich	M7145
Microplate Reader	BMG LabTech	NOVOstar
PBS	Sigma Aldrich	D8537	Phosphate-buffered saline
penicillin G sodium/streptomycin sulfate	Sigma Aldrich	P0781
Pluronic F127	Sigma Aldrich	P2443
Trypsin-EDTA	Sigma Aldrich	T4299
T-75 flask	Sigma Aldrich	CLS3972
96-well plate	Corning incorporated	3603