本文的目标是提供一种标准化的方法,诱导人类肝祖细胞与多能干细胞的分化。这种程序的开发与即用媒体配方为用户提供了一个方便的系统,以产生人类肝细胞的生物医学研究和翻译。
肝病是一个不断升级的全球健康问题。虽然肝移植是一种有效的治疗方式,但由于供体器官供应不足,患者死亡率有所上升。器官短缺也影响人类肝细胞用于基础研究和临床的日常供应。因此,开发人类肝祖细胞的可再生来源是可取的,也是本研究的目标。为了能够大规模有效地生成和部署人类肝脏祖传,开发了可重复的肝祖分化系统。该协议有助于使用一系列细胞培养皿格式的用户之间的实验可重复性,并允许使用人类胚胎和诱导多能干细胞系进行区分。这些是现有分化系统的重要优势,将加强基础研究,并可能为临床产品开发铺平道路。
肝病是一个全球性的健康挑战,每年在全球造成约200万人死亡。虽然存在许多模型系统来研究肝病和临床干预,但细胞系统常规使用受到重大缺陷的限制(供审查见Szkolnicka等人)。先进的人类多能干细胞(hPSC)培养和体细胞分化方法代表了为临床3、4开发基础生物医学研究和分化细胞可再生能源的有前途的技术。
迄今为止,肝细胞分化的多个协议已经开发出5,6,7,8。这些协议试图利用小分子和生长因子9,10的组合来重建人类肝脏发育的各个方面。大多数协议包括一个循序渐进的分化过程,其中 hPSC 被准备为确定内皮,然后是肝祖体规范 11,12,13,并以 HLC 规范结束。这些协议产生的HLC显示胎儿和成人表型的混合物。这包括α胎儿蛋白(法新社)的表达,如肝细胞标记,如HNF4+和白蛋白(ALB),以及药物代谢能力14,15,16。在实验室之间,HLC 的差异可能有所不同:因此,制定标准化协议是必要的。这将使研究人员能够有效地生成和应用干细胞衍生的HLC大规模的基础和临床研究。
开发了一种肝祖分化系统,该系统可以使用易于遵循的指南应用于人类胚胎和诱导多能干细胞系。这个过程产生异质种群的肝祖体在不同的培养皿格式,从细胞培养瓶到96井板。提供以下协议,以24和96井的形式产生干细胞衍生肝祖。
下面介绍的协议中使用的细胞密度分别指定为 24 井和 96 井板的一口井(参见 表 1)。不同细胞培养板格式和细胞线需要优化起始单元格编号。建议启动细胞密度协议优化是2×105 细胞/厘米2。对于密度优化,可以通过一次添加 50,000 个单元格/cm2 ±来测试多个单元格密度。
大规模地从多能干细胞中产生人类肝祖细胞,可能是尸体衍生材料的有希望的替代品。协议标准化和可重复性是确保生物医学研究的技术翻译和影响的关键。为了解决这个问题,以前的工作重点是开发一个步骤分化协议从hESC和iPSC使用定义的添加剂和矩阵15,23,24,25,26,27,28。通过这样做,肝细胞表型和可重复性得到了改善,使分化过程的半自动化。所呈现的系统通过与现成的细胞培养介质和方便的肝细胞分化系统的结合而得到加强。
此前,多能细胞密度在分化方案开始前被强调为实现肝祖细胞同质种群的关键变量26。利用这个更精细的程序,可以使用一系列启动细胞密度(表1)逐步产生大量的干细胞衍生肝祖。在第5天,最终的内皮诱导被Six17染色(图3)验证。通过测试的ESC和iPSC线实现了对最终内皮的高效和强大的分化,超过80%的表达Six17(图3)。在第10天,肝祖系显示出一种均匀的鹅卵石状形态,肝干细胞标记对法新社和HNF4+(>86%,图4)都非常丰富。使用手动和半自动化技术的组合,可以执行多种板格式的区分19。
以目前的形式,细胞分化适用于 体外 实验。然而,在临床应用之前可能需要细胞浓缩,以确保肝祖体的同质种群为分娩做好准备。
最后,这里描述的协议为该领域提供了一个标准化的方法,以大规模地产生肝祖。未来的工作将侧重于生产用于后续 HLC 分化、成熟和维护的新介质。
The authors have nothing to disclose.
这项研究得到了MRC博士培训伙伴关系(MR/K501293/1)、英国再生医学平台(MRC MR/L022974/1和M/K026666/1)、首席科学家办公室(TCS/16/37)的奖项的支持。
DPBS with Calcium and Magnesium | ThermoFisher | 14040133 | |
Gentle cell dissociation reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | |
Hoechst 33342 Ready Flow Reagent | thermofisher | R37165 | |
Human Recombinant Laminin 521 | BioLamina | LN521-02 | |
Human Serum Albumin ELISA | Alpha Diagnostics | 1190 | |
Human Serum Alpha Fetoprotein ELISA | Alpha Diagnostics | 500 | |
mTeSR1 medium | STEMCELL Technologies | 5850 | |
Operetta High-Content Imaging System | PerkinElmer | HH12000000 | |
PBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14190250 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140122 | |
Rho-associated kinase (ROCK)inhibitor Y27632 | Sigma-Aldrich | Y0503-1MG | |
STEMdiff Definitive Endoderm Supplement CJ | STEMCELL Technologies | ||
STEMdiff Definitive Endoderm Supplement MR | STEMCELL Technologies | ||
STEMdiff Endoderm Basal Medium | STEMCELL Technologies | ||
STEMdiff Hepatic Progenitor Medium | STEMCELL Technologies | ||
TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
Antibodies | |||
Albumin | Sigma-Aldrich | A6684 | 1:200 (mouse) |
Alpha-fetoprotein | Sigma-Aldrich | A8452 | 1:400 (mouse) |
HNF-4α | Santa Cruz | sc-8987 | 1:400 (rabbit) |
IgG | DAKO | 1:400 | |
Sox17 | R&D Systems, Inc. | AF1924 | 1:200 (Goat) |
Software | |||
Columbus Image Data Storage and Analysis system | PerkinElmer |