L’objectif de cet article est de fournir une approche standardisée pour induire la différenciation des progéniteurs hépatiques humains à partir de cellules souches pluripotentes. Le développement de cette procédure avec des formulations de milieux prêtes à l’emploi offre à l’utilisateur un système facile pour générer des cellules hépatiques humaines pour la recherche biomédicale et la traduction.
La maladie du foie est un problème de santé mondial croissant. Bien que la transplantation hépatique soit un mode de traitement efficace, la mortalité des patients a augmenté en raison de la pénurie de disponibilité des organes des donneurs. La rareté des organes affecte également l’approvisionnement de routine en hépatocytes humains pour la recherche fondamentale et la clinique. Par conséquent, le développement de sources renouvelables de cellules progéniatrices hépatiques humaines est souhaitable et constitue l’objectif de cette étude. Pour pouvoir générer et déployer efficacement des progéniteurs hépatiques humains à grande échelle, un système de différenciation hépatique reproductible des progéniteurs a été développé. Ce protocole facilite la reproductibilité expérimentale entre les utilisateurs dans une gamme de formats de logiciels de culture cellulaire et permet des différenciations en utilisant à la fois des lignées de cellules souches embryonnaires humaines et pluripotentes induites. Ce sont des avantages importants par rapport aux systèmes de différenciation actuels qui amélioreront la recherche fondamentale et pourraient ouvrir la voie au développement de produits cliniques.
Les maladies du foie représentent un défi sanitaire mondial, causant environ 2 millions de décès par an dans le monde1. Bien qu’il existe un certain nombre de systèmes modèles pour étudier les maladies hépatiques et intervenir cliniquement, l’utilisation systématique de systèmes cellulaires est limitée par des inconvénients importants (pour une revue, voir Szkolnicka et al.2). Les méthodes avancées de culture de cellules souches pluripotentes humaines (hPSC) et de différenciation des cellules somatiques représentent des technologies prometteuses pour développer des outils pour la recherche biomédicale fondamentale et des sources renouvelables de cellules différenciées pour la clinique3,4.
À ce jour, de multiples protocoles de différenciation des cellules de type hépatocytaire (HLC) ont étédéveloppés5,6,7,8. Ces protocoles tentent de recréer des aspects du développement du foie humain en utilisant une combinaison de petites molécules et de facteurs de croissance9,10. La plupart des protocoles consistent en un processus de différenciation par étapes, où les hPSC sont amorcés à l’endoderme définitif, suivi de la spécification du progéniteur hépatique11,12,13, et se terminant par la spécification HLC. Les HPC produits par ces protocoles présentent un mélange de phénotypes fœtaux et adultes. Cela inclut l’expression de l’alpha fœtoprotéine (AFP), tels que les marqueurs hépatocytaires tels que HNF4α et l’albumine (ALB), ainsi que la capacité de métabolisation desmédicaments 14,15,16. D’un laboratoire à l’autre, la différenciation des HLC peut varier; par conséquent, l’élaboration de protocoles normalisés est nécessaire. Cela permettra aux chercheurs de générer et d’appliquer efficacement des HPC dérivés de cellules souches à grande échelle pour la recherche fondamentale et clinique.
Un système de différenciation des progéniteurs hépatiques a été développé qui peut être appliqué à la fois à des lignées de cellules souches embryonnaires humaines et pluripotentes induites en utilisant des lignes directrices faciles à suivre. Cette procédure donne des populations homogènes de progéniteurs hépatiques dans différents formats de culture, allant des flacons de culture cellulaire aux plaques de 96 puits. Vous trouverez ci-dessous le protocole pour produire des progéniteurs hépatiques dérivés de cellules souches dans des formats de puits 24 et 96.
La densité cellulaire utilisée dans le protocole présenté ci-dessous est spécifiée pour un puits d’une plaque de 24 et 96 puits respectivement (voir tableau 1). L’optimisation du numéro de cellule de départ est nécessaire pour les différents formats de plaques de culture cellulaire et les lignées cellulaires. La densité de cellule de départ suggérée pour l’optimisation du protocole est de 2 x10 5 cellules/cm2. Pour l’optimisation de la densité, plusieurs densités de cellules peuvent être testées en ajoutant ± 50 000 cellules/cm2 à la fois.
La génération de cellules progéniatrices hépatiques humaines à partir de cellules souches pluripotentes à grande échelle pourrait représenter une alternative prometteuse au matériel dérivé du cadavre. La normalisation et la reproductibilité des protocoles sont essentielles pour assurer l’application de la technologie et l’impact de la recherche biomédicale. Pour y remédier, les travaux antérieurs se sont concentrés sur le développement d’un protocole de différenciation par étapes des CSEh et des CS IPS en utilisant des additifs définis et des matrices15,23,24 ,25,26,27,28. Ce faisant, le phénotype des hépatocytes et la reproductibilité ont été améliorés, permettant la semi-automatisation du processus de différenciation19. Le système présenté est renforcé par sa combinaison avec des milieux de culture cellulaire prêts à l’emploi et un système facile de différenciation des hépatocytes.
Auparavant, la densité des cellules pluripotentes avant le début du protocole de différenciation était mise en évidence comme une variable clé pour atteindre une population homogène de cellules progéniatrices hépatiques26. En utilisant cette procédure plus raffinée, il est possible de générer un grand nombre de progéniteurs hépatiques dérivés de cellules souches de manière progressive en utilisant une gamme de densités cellulaires de départ (Tableau 1). Au jour 5, l’induction définitive de l’endoderme a été validée par coloration Sox17(Figure 3). Une différenciation efficace et robuste en endoderme définitif a été obtenue avec les lignes ESC et iPSC testées, avec plus de 80% exprimant Sox17(Figure 3). Au jour 10, les progéniteurs hépatiques présentaient une morphologie pavée uniforme, et les marqueurs de cellules souches hépatiques étaient fortement enrichis pour l’AFP et le HNF4α (>86%, Figure 4). En utilisant une combinaison de technologies manuelles et semi-automatisées, il a été possible d’effectuer une différenciation dans plusieurs formats de plaques19.
Dans sa forme actuelle, la différenciation cellulaire convient à l’expérimentation in vitro. Cependant, l’enrichissement cellulaire serait probablement nécessaire avant l’application clinique pour s’assurer qu’une population homogène de progéniteurs hépatiques est préparée pour l’administration.
En conclusion, le protocole décrit ici fournit au domaine une approche standardisée pour produire des progéniteurs hépatiques à grande échelle. Les travaux futurs se concentreront sur la production d’un nouveau support pour la différenciation, la maturation et la maintenance ultérieures des HLC.
The authors have nothing to disclose.
Cette étude a été soutenue par des bourses du MRC Doctoral Training Partnership (MR/K501293/1), de la UK Regenerative Medicine Platform (MRC MR/L022974/1 et MR/K026666/1), du Chief Scientist Office (TCS/16/37).
DPBS with Calcium and Magnesium | ThermoFisher | 14040133 | |
Gentle cell dissociation reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | |
Hoechst 33342 Ready Flow Reagent | thermofisher | R37165 | |
Human Recombinant Laminin 521 | BioLamina | LN521-02 | |
Human Serum Albumin ELISA | Alpha Diagnostics | 1190 | |
Human Serum Alpha Fetoprotein ELISA | Alpha Diagnostics | 500 | |
mTeSR1 medium | STEMCELL Technologies | 5850 | |
Operetta High-Content Imaging System | PerkinElmer | HH12000000 | |
PBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14190250 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140122 | |
Rho-associated kinase (ROCK)inhibitor Y27632 | Sigma-Aldrich | Y0503-1MG | |
STEMdiff Definitive Endoderm Supplement CJ | STEMCELL Technologies | ||
STEMdiff Definitive Endoderm Supplement MR | STEMCELL Technologies | ||
STEMdiff Endoderm Basal Medium | STEMCELL Technologies | ||
STEMdiff Hepatic Progenitor Medium | STEMCELL Technologies | ||
TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
Antibodies | |||
Albumin | Sigma-Aldrich | A6684 | 1:200 (mouse) |
Alpha-fetoprotein | Sigma-Aldrich | A8452 | 1:400 (mouse) |
HNF-4α | Santa Cruz | sc-8987 | 1:400 (rabbit) |
IgG | DAKO | 1:400 | |
Sox17 | R&D Systems, Inc. | AF1924 | 1:200 (Goat) |
Software | |||
Columbus Image Data Storage and Analysis system | PerkinElmer |