本稿の目的は、多能性幹細胞からのヒト肝前駆物質分化を誘導する標準化されたアプローチを提供することです。すぐに使用できるメディア製剤を用いたこの手順の開発は、生物医学の研究と翻訳のためのヒト肝細胞を生成する容易なシステムをユーザーに提供する。
肝疾患は世界的な健康問題のエスカレートです。肝臓移植は効果的な治療法ですが、ドナー臓器の入手不足により患者の死亡率が増加しています。臓器不足は、基礎研究やクリニックのためのヒト肝細胞の日常的な供給にも影響を及ぼす。したがって、ヒト肝前駆細胞の再生可能な供給源の開発が望ましく、本研究の目標である。ヒト肝前駆物質を大規模に効果的に生成・展開できるように、再現性肝前駆物質分化システムを開発した。このプロトコルは、さまざまな細胞培養器形式のユーザー間の実験的再現を支援し、ヒト胚性幹細胞および人工多能性幹細胞株の両方を使用して分化を可能にする。これらは、基礎研究を強化し、臨床製品開発への道を開く可能性があり、現在の分化システムよりも重要な利点です。
肝臓病は世界的な健康問題であり、世界で年間約200万人の死亡を引き起こしている。肝疾患を研究し、臨床的に介入するモデルシステムの数が存在するが、細胞系システムの日常的な使用は重大な欠点によって制限される(レビューのためにSzkolnickaらら2参照)。高度なヒト多能性幹細胞(hPSC)培養および体細胞分化法は、クリニック3,4の分化細胞の基礎生物医学研究および再生可能な分化源のためのツールを開発する有望な技術を表す。
現在までに、肝細胞様細胞(HLC)分化のための複数のプロトコルが5、6、7、8に開発されてきた。これらのプロトコルは、低分子と成長因子9,10を組み合わせて、ヒト肝臓の発達の側面を再現しようとします。ほとんどのプロトコルは段階的な分化プロセスで構成され、hPSCは決定的なエンドドームにプライミングされ、続いて肝前駆子仕様11、12、13がHLC仕様で終わる。これらのプロトコルによって生成されたHlcは、胎児と成人のフェノタイプの混合物を表示する。これには、HNF4αおよびアルブミン(ALB)などの肝細胞マーカー、ならびに薬物代謝容量14、15、16などのαフェトプロテイン(AFP)の発現が含まれる。研究所間で, HLC 分化は異なる場合があります。したがって、標準化されたプロトコルの開発が必要です。これにより、研究者は、幹細胞由来のHLCを大規模に生成し、基礎的および臨床的研究に効果的に適用することができます。
ヒト胚性幹細胞と誘導多能性幹細胞株の両方に適用できる肝前駆細胞分化システムが開発されました。この手順は、細胞培養フラスコから96ウェルプレートに至るまで、様々な培養器形式で肝前駆細胞の均質集団を生み出す。以下に提供されるプロトコルは、幹細胞由来の肝前駆物質を24および96のウェルフォーマットで生成する。
以下に示すプロトコルで使用されるセル密度は、それぞれ24および96ウェルプレートの1つのウェルに対して指定される( 表1を参照)。異なる細胞培養板フォーマットおよび細胞株に対しては、開始細胞数の最適化が必要である。プロトコル最適化の開始セル密度は、2 x 105 セル/cm2です。密度最適化のために、一度に50,000個のセル/cm2± を追加することで、複数のセル密度をテストできます。
大規模に多能性幹細胞からヒト肝前駆細胞を生成することは、死体由来の物質に代わる有望な代替手段を表す可能性がある。プロトコルの標準化と再現性は、バイオメディカル研究における技術翻訳とインパクトを確保するための鍵です。これに対処するために、以前の研究では、定義された添加剤と行列15、23、24、25、26、27、28を使用して、hESCおよびiPSCからの段階的な差別化プロトコルの開発に焦点を当てていました。これを行うことにより、肝細胞表現型と再現性が向上し、分化プロセス19の半自動化が可能となった。提供されるシステムは、既製の細胞培養培地および容易な肝細胞分化システムとの組み合わせによって強化される。
以前は、分化プロトコルの開始前に多能性細胞密度が肝前駆細胞26の均質集団を達成するための重要な変数として強調された。このより洗練された手順を用いて、開始細胞密度の範囲を用いて段階的に多数の幹細胞由来肝前駆細胞を生成することができる(表1)。5日目に、Sox17染色法により決定的な内胚誘発が検証された(図3)。試験したESCとiPSCの両方のラインで、80%以上がSox17を発現することで、決定的な内胚葉への効率的かつ堅牢な分化が達成されました(図3)。10日目には、肝前駆物質は均一な石畳様の形態を示し、肝幹細胞マーカーはAFPとHNF4αの両方に対して高度に濃縮された(>86%、 図4)。手動技術と半自動技術を組み合わせて使用して、複数のプレートフォーマット19で分化を行うことが可能でした。
その現在の形態では、細胞分化は 、インビトロ ベースの実験に適している。しかし、肝前駆物質の均質な集団が送達のために準備されるようにするために、臨床応用の前に細胞濃縮が必要になる可能性が高い。
結論として、ここで説明するプロトコルは、大規模に肝前駆物質を生成するための標準化されたアプローチを分野に提供する。今後の作業は、HLCの分化、成熟、およびメンテナンスのための新しい媒体の生産に焦点を当てます。
The authors have nothing to disclose.
この研究は、MRC博士研修パートナーシップ(MR/K501293/1)、英国再生医療プラットフォーム(MRC MR/L022974/1およびMR/K026666/1)、チーフサイエンティストオフィス(TCS/16/37)からの賞でサポートされました。
DPBS with Calcium and Magnesium | ThermoFisher | 14040133 | |
Gentle cell dissociation reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | |
Hoechst 33342 Ready Flow Reagent | thermofisher | R37165 | |
Human Recombinant Laminin 521 | BioLamina | LN521-02 | |
Human Serum Albumin ELISA | Alpha Diagnostics | 1190 | |
Human Serum Alpha Fetoprotein ELISA | Alpha Diagnostics | 500 | |
mTeSR1 medium | STEMCELL Technologies | 5850 | |
Operetta High-Content Imaging System | PerkinElmer | HH12000000 | |
PBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14190250 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140122 | |
Rho-associated kinase (ROCK)inhibitor Y27632 | Sigma-Aldrich | Y0503-1MG | |
STEMdiff Definitive Endoderm Supplement CJ | STEMCELL Technologies | ||
STEMdiff Definitive Endoderm Supplement MR | STEMCELL Technologies | ||
STEMdiff Endoderm Basal Medium | STEMCELL Technologies | ||
STEMdiff Hepatic Progenitor Medium | STEMCELL Technologies | ||
TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
Antibodies | |||
Albumin | Sigma-Aldrich | A6684 | 1:200 (mouse) |
Alpha-fetoprotein | Sigma-Aldrich | A8452 | 1:400 (mouse) |
HNF-4α | Santa Cruz | sc-8987 | 1:400 (rabbit) |
IgG | DAKO | 1:400 | |
Sox17 | R&D Systems, Inc. | AF1924 | 1:200 (Goat) |
Software | |||
Columbus Image Data Storage and Analysis system | PerkinElmer |