이 문서의 목표는 만능 줄기 세포로부터 인간 간 선구분화를 유도하는 표준화된 접근법을 제공하는 것입니다. 즉시 사용 가능한 미디어 제형이 있는 이 절차의 개발은 사용자에게 생체 의학 연구 및 번역을 위한 인간 간 세포를 생성하는 촉진 시스템을 제공합니다.
간 질환은 증가하는 글로벌 건강 문제입니다. 간 이식은 치료의 효과적인 모드인 동안, 기증자 기관 가용성에 있는 부족으로 인해 환자 사망률이 증가했습니다. 장기 부족은 또한 기본적인 연구 및 진료소를 위한 인간 간세포의 일상적인 공급에 영향을 미칩니다. 따라서 인간 간 전구 세포의 재생 가능한 소스의 개발이 바람직하며이 연구의 목표입니다. 인간 간 전구를 대규모로 효과적으로 생성및 배치할 수 있도록, 재현가능한 간 선조 분화 시스템이 개발되었다. 이 프로토콜은 다양한 세포 배양기 형식의 사용자 간의 실험 재현성을 돕고 인간 배아 및 유도된 만능 줄기 세포주를 사용하여 분화를 허용합니다. 이들은 기본적인 연구를 강화하고 임상 제품 개발을 향해 길을 열 수 있습니다 현재 분화 시스템에 비해 중요한 장점이다.
간 질환은 전 세계적으로 연간 약 2백만 명의 사망을 초래하는 글로벌 건강 문제를 나타냅니다1. 많은 모델 시스템이 간 질환을 연구하고 임상적으로 개입하기 위해 존재하지만, 세포 기반 시스템의 일상적인 사용은 상당한 단점에 의해 제한됩니다 (검토를 위해 Szkolnicka 외.2참조). 첨단 인간 다능성 줄기세포(hPSC) 배양 및 체세포 분화 방법은 클리닉3,4를위한 분화세포의 기본 생체 의학 연구 및 재생 가능한 공급원을 위한 도구를 개발하는 유망한 기술을 나타낸다.
현재까지, 간세포형 세포(HLC)를 위한 다중 프로토콜이 개발되었다5,6,7,8. 이러한 프로토콜은 작은 분자와 성장 인자의 조합을 사용하여 인간 간 발달의 측면을 재현하려고9,10. 대부분의 프로토콜은 hPSC가 최종 종말에 준비되어 있는 단계별 분화 과정으로 구성되며, 그 다음으로 간 선조 사양11,12,13,HLC 사양으로 끝납니다. 이러한 프로토콜에 의해 생성된 HLCs는 태아와 성인용 표현형의 혼합물을 표시합니다. 여기에는 HNF4α 및 알부민(ALB)과 같은 간세포 마커와 같은 알파 페토프로틴(AFP)의 발현뿐만 아니라 약물 대사용량(14,15,16)이 포함됩니다. 실험실 간에 HLC 분화는 다를 수 있습니다. 따라서 표준화된 프로토콜의 개발이 필요합니다. 이를 통해 연구자들은 기본 및 임상 연구를 위해 줄기 세포 에서 파생된 HLC를 대규모로 효과적으로 생성하고 적용할 수 있습니다.
간 선구분화 시스템은 따르기 쉬운 지침을 사용하여 인간 배아 및 유도된 만능 줄기 세포주 모두에 적용될 수 있는 개발되었다. 이 절차는 세포 배양 플라스크에서 96 개의 웰 플레이트에 이르기까지 다양한 배양기 형식으로 간 선조의 균질한 인구를 산출합니다. 아래 제공된 프로토콜은 줄기 세포 유래 간 선조를 24 및 96 웰 포맷으로 생산하는 프로토콜이다.
아래에 제시된 프로토콜에 사용되는 세포 밀도는 각각 24 및 96 웰 플레이트의 한 웰에 대해 지정됩니다(표 1참조). 상이한 세포 배양 플레이트 포맷 및 세포주에 대해 시작 세포 수의 최적화가 요구된다. 프로토콜 최적화를 위한 제안된 시작 세포 밀도는 2 x 105 세포/cm2이다. 밀도 최적화를 위해, 한 번에 50,000개의 세포/cm2를 ± 추가하여 여러 세포 밀도를 테스트할 수 있습니다.
대규모로 만능 줄기 세포로부터 인간 간 전구 세포의 생성은 시체 유래 물질에 대한 유망한 대안을 나타낼 수 있습니다. 프로토콜 표준화 및 재현성은 생체 의학 연구에 대한 기술 번역 및 영향을 보장하는 데 핵심적입니다. 이를 해결하기 위해, 이전 작품은 정의된 첨가제 및 매트릭스 15,23,24,25,26,27,28을사용하여 hESC 및 iPSC로부터 단계적 차별화 프로토콜을 개발하는 데주력하고 있다. 이를 통해, 간세포 표현형 및 재현성이 개선되어 분화공정(19)의반자동화를 허용한다. 제시된 시스템은 기성 세포 배양 매체 및 촉진 간세포 분화 시스템과의 조합으로 강화됩니다.
이전에는 분화 프로토콜이 시작되기 전에 만능 세포 밀도가 간 선조 세포의 균질한 집단을 달성하기 위한 핵심 변수로강조되었다(26). 이러한 보다 정제된 절차를 이용하여, 다양한 세포밀도(표 1)를이용하여 단계적으로 줄기세포 유래 간 전구체를 단계적으로 생성할 수 있다. 5일째, 최종 엔도름 유도는 Sox17염색(도 3)에의해 검증되었다. 최종 엔도름으로 효율적이고 견고한 분화는 테스트된 ESC 및 iPSC 라인 모두에서 달성되었으며, 80% 이상이 Sox17(그림3)을발현했습니다. 10일째에, 간 선조들은 균일한 조약돌 같이 형태를 보였고, 간 줄기세포 마커는 AFP와 HNF4α(>86%, 도 4)에대해 높게 농축되었다. 수동 및 반자동 기술의 조합을 사용하여 다중 플레이트포맷(19)에서차별화를 수행할 수 있었다.
현재 의 형태로, 세포 분화는 시험관 내 실험에 적합합니다. 그러나, 세포 농축은 간 선조의 균질한 인구가 납품을 위해 준비된다는 것을 확인하기 위하여 임상 신청 의 앞에 요구될 것입니다.
결론적으로, 여기서 설명된 프로토콜은 대규모로 간 선조를 생성하는 표준화된 접근법을 필드에 제공한다. 향후 작업은 후속 HLC 차별화, 성숙 및 유지 보수를 위한 새로운 매체의 생산에 초점을 맞출 것입니다.
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 MRC 박사 훈련 파트너십 (MR /K501293/1), 영국 재생 의학 플랫폼 (MRC MR /L022974/1 및 MR/K02666/1), 수석 과학자 사무소 (TCS/16/37)의 수상으로 지원되었습니다.
DPBS with Calcium and Magnesium | ThermoFisher | 14040133 | |
Gentle cell dissociation reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | |
Hoechst 33342 Ready Flow Reagent | thermofisher | R37165 | |
Human Recombinant Laminin 521 | BioLamina | LN521-02 | |
Human Serum Albumin ELISA | Alpha Diagnostics | 1190 | |
Human Serum Alpha Fetoprotein ELISA | Alpha Diagnostics | 500 | |
mTeSR1 medium | STEMCELL Technologies | 5850 | |
Operetta High-Content Imaging System | PerkinElmer | HH12000000 | |
PBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14190250 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140122 | |
Rho-associated kinase (ROCK)inhibitor Y27632 | Sigma-Aldrich | Y0503-1MG | |
STEMdiff Definitive Endoderm Supplement CJ | STEMCELL Technologies | ||
STEMdiff Definitive Endoderm Supplement MR | STEMCELL Technologies | ||
STEMdiff Endoderm Basal Medium | STEMCELL Technologies | ||
STEMdiff Hepatic Progenitor Medium | STEMCELL Technologies | ||
TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
Antibodies | |||
Albumin | Sigma-Aldrich | A6684 | 1:200 (mouse) |
Alpha-fetoprotein | Sigma-Aldrich | A8452 | 1:400 (mouse) |
HNF-4α | Santa Cruz | sc-8987 | 1:400 (rabbit) |
IgG | DAKO | 1:400 | |
Sox17 | R&D Systems, Inc. | AF1924 | 1:200 (Goat) |
Software | |||
Columbus Image Data Storage and Analysis system | PerkinElmer |