Målet med denne artikkelen er å gi en standardisert tilnærming for å indusere menneskelig levergenitordifferensiering fra pluripotente stamceller. Utviklingen av denne prosedyren med bruksklare medieformuleringer gir brukeren et facile-system for å generere menneskelige leverceller for biomedisinsk forskning og oversettelse.
Leversykdom er et eskalerende globalt helseproblem. Mens levertransplantasjon er en effektiv behandlingsmåte, har pasientdødeligheten økt på grunn av mangel på donororgantilgjengelighet. Organmangel påvirker også rutinemessig tilførsel av menneskelige hepatocytter for grunnleggende forskning og klinikken. Derfor er utviklingen av fornybare kilder til humane leverforfederceller ønskelig og er målet med denne studien. For å kunne effektivt generere og distribuere menneskelige leverforfedre i stor skala, ble det utviklet et reproduserbart hepatisk stamcelledifferensieringssystem. Denne protokollen hjelper eksperimentell reproduserbarhet mellom brukere i en rekke cellekulturelle formater og tillater differensieringer ved hjelp av både humane embryonale og induserte pluripotente stamcellelinjer. Dette er viktige fordeler i forhold til dagens differensieringssystemer som vil forbedre grunnforskningen og kan bane vei for klinisk produktutvikling.
Leversykdom representerer en global helseutfordring, forårsaker ca 2 millioner dødsfall per år over hele verden1. Selv om det finnes en rekke modellsystemer for å studere leversykdommer og gripe inn klinisk, er rutinemessig bruk av cellebaserte systemer begrenset av betydelige ulemper (for en gjennomgang se Szkolnicka et al.2). Avansert human pluripotent stamcelle (hPSC) kultur og somatiske celle differensieringsmetoder representerer lovende teknologier for å utvikle verktøy for grunnleggende biomedisinsk forskning og fornybare kilder til differensierte celler for klinikken3,4.
Til dags dato er flere protokoller for hepatocyttlignende celle (HLC) differensiering utviklet5,6,7,8. Disse protokollene forsøker å gjenskape aspekter av menneskelig leverutvikling ved hjelp av en kombinasjon av små molekyler og vekstfaktorer9,10. De fleste protokoller består av en trinnvis differensieringsprosess, der hPSCer er primet til definitiv endoderm, etterfulgt av hepatisk stamcellespesifikasjon11,12,13og slutter med HLC-spesifikasjon. HLCer produsert av disse protokollene viser en blanding av foster og voksne fenotyper. Dette inkluderer uttrykket av alfafetokprotein (AFP), for eksempel hepatocyttmarkører som HNF4α og albumin (ALB), samt legemiddelmetaboliseringskapasitet14,15,16. Mellom laboratorier kan HLC-differensiering variere; Derfor er utviklingen av standardiserte protokoller nødvendig. Dette vil gjøre det mulig for forskere å effektivt generere og anvende stamcelleavledede HLCer i stor skala for grunnleggende og klinisk forskning.
Et hepatisk stamcelledifferensieringssystem ble utviklet som kan brukes på både humane embryonale og induserte pluripotente stamcellelinjer ved hjelp av enkle å følge retningslinjer. Denne prosedyren gir homogene populasjoner av leverforfedere i forskjellige kulturvareformater, alt fra cellekulturflasker til 96 brønnplater. Nedenfor er protokollen for å produsere stamcelleavledede leverforfedere i 24 og 96 brønnformater.
Celletettheten som brukes i protokollen som presenteres nedenfor, er spesifisert for en brønn på henholdsvis 24 og 96 brønnplater (se tabell 1). Optimalisering av startcellenummeret kreves for de forskjellige cellekulturplateformatene og cellelinjene. Foreslått startcelletetthet for protokolloptimalisering er 2 x 105 celler/cm2. For tetthetsoptimalisering kan flere celletettheter testes ved å legge til ± 50 000 celler/cm2 om gangen.
Genereringen av humane levergenitorceller fra pluripotente stamceller i stor skala kan representere et lovende alternativ til kadaveraveravledet materiale. Protokollstandardisering og reproduserbarhet er nøkkelen til å sikre teknologioversettelse og innvirkning for biomedisinsk forskning. For å løse dette har tidligere arbeid fokusert på å utvikle en trinnvis differensieringsprotokoll fra hESC og iPSCer ved hjelp av definerte tilsetningsstoffer og matriser15,23,24,25,26,27,28. Ved å gjøre dette har hepatocytt fenotype og reproduserbarhet blitt forbedret, slik at halvautomatiseringen av differensieringsprosessen19. Systemet som presenteres styrkes av kombinasjonen med hyllecellekulturmedier og et facile hepatocyte differensieringssystem.
Tidligere ble pluripotent celletetthet før starten av differensieringsprotokollen fremhevet som en nøkkelvariabel for å oppnå en homogen populasjon av leverforfederceller26. Ved hjelp av denne mer raffinerte prosedyren er det mulig å generere et stort antall stamcelleavledede leverforfedere på en trinnvis måte ved hjelp av et område med startcelletettheter (Tabell 1). På dag 5 ble definitiv endoderm induksjon validert av Sox17 farging (figur 3). Effektiv og robust differensiering i definitiv endoderm ble oppnådd med både testede ESC- og iPSC-linjer, med mer enn 80% som uttrykker Sox17 (Figur 3). På dag 10 viste leverforfedere en jevn brosteinlignende morfologi, og leverstammecellemarkører ble sterkt beriket for både AFP og HNF4α (>86%, figur 4). Ved hjelp av en kombinasjon av manuelle og halvautomatiske teknologier var det mulig å utføre differensiering i flere plateformater19.
I sin nåværende form er celledifferensiering egnet for in vitro-basert eksperimentering. Imidlertid vil celleberikelse sannsynligvis være nødvendig før klinisk anvendelse for å sikre at en homogen populasjon av leverforfedere er forberedt på levering.
Til slutt gir protokollen som er beskrevet her feltet en standardisert tilnærming for å produsere leverforfedere i stor skala. Fremtidig arbeid vil fokusere på produksjon av et nytt medium for påfølgende HLC-differensiering, modning og vedlikehold.
The authors have nothing to disclose.
Denne studien ble støttet med priser fra MRC Doctoral Training Partnership (MR/K501293/1), UK Regenerative Medicine Platform (MRC MR/L022974/1 og MR/K026666/1), Chief Scientist Office (TCS/16/37).
DPBS with Calcium and Magnesium | ThermoFisher | 14040133 | |
Gentle cell dissociation reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | |
Hoechst 33342 Ready Flow Reagent | thermofisher | R37165 | |
Human Recombinant Laminin 521 | BioLamina | LN521-02 | |
Human Serum Albumin ELISA | Alpha Diagnostics | 1190 | |
Human Serum Alpha Fetoprotein ELISA | Alpha Diagnostics | 500 | |
mTeSR1 medium | STEMCELL Technologies | 5850 | |
Operetta High-Content Imaging System | PerkinElmer | HH12000000 | |
PBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14190250 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140122 | |
Rho-associated kinase (ROCK)inhibitor Y27632 | Sigma-Aldrich | Y0503-1MG | |
STEMdiff Definitive Endoderm Supplement CJ | STEMCELL Technologies | ||
STEMdiff Definitive Endoderm Supplement MR | STEMCELL Technologies | ||
STEMdiff Endoderm Basal Medium | STEMCELL Technologies | ||
STEMdiff Hepatic Progenitor Medium | STEMCELL Technologies | ||
TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
Antibodies | |||
Albumin | Sigma-Aldrich | A6684 | 1:200 (mouse) |
Alpha-fetoprotein | Sigma-Aldrich | A8452 | 1:400 (mouse) |
HNF-4α | Santa Cruz | sc-8987 | 1:400 (rabbit) |
IgG | DAKO | 1:400 | |
Sox17 | R&D Systems, Inc. | AF1924 | 1:200 (Goat) |
Software | |||
Columbus Image Data Storage and Analysis system | PerkinElmer |