Целью данной статьи является обеспечение стандартизированного подхода к индуцированию дифференцировки гениатора печенки человека из плюрипотентных стволовых клеток. Разработка этой процедуры с готовыми к использованию составами сред предлагает пользователю факционную систему для генерации клеток печени человека для биомедицинских исследований и перевода.
Заболевания печени — это обостряющаяся глобальная проблема здравоохранения. В то время как трансплантация печени является эффективным способом терапии, смертность пациентов увеличилась из-за нехватки донорских органов. Дефицит органов также влияет на рутинное снабжение человека гепатоцитами для фундаментальных исследований и клиники. Поэтому разработка возобновляемых источников клеток-прогениторов печени человека желательна и является целью данного исследования. Чтобы иметь возможность эффективно генерировать и развертывать прародителей печени человека в больших масштабах, была разработана воспроизводимая система дифференциации печеночных прародителей. Этот протокол способствует экспериментальной воспроизводимости между пользователями в различных форматах клеточных культур и позволяет дифференцировать как эмбриональные, так и индуцированные линии плюрипотентных стволовых клеток человека. Это важные преимущества по сравнению с современными системами дифференциации, которые улучшат фундаментальные исследования и могут проложить путь к разработке клинических продуктов.
Заболевания печени представляют собой глобальную проблему в области здравоохранения, вызывая примерно 2 миллиона смертей в год во всем мире1. Хотя существует ряд модельных систем для изучения заболеваний печени и клинического вмешательства, рутинное использование клеточных систем ограничено значительными недостатками (для обзора см. Szkolnicka et al.2). Передовые методы культуры плюрипотентных стволовых клеток человека (hPSC) и дифференцировки соматических клеток представляют собой перспективные технологии для разработки инструментов фундаментальных биомедицинских исследований и возобновляемых источников дифференцированных клеток дляклиники 3,4.
На сегодняшний день разработаны множественные протоколы дифференцировки гепатоцитоподобных клеток (ГЛК)5,6,7,8. Эти протоколы пытаются воссоздать аспекты развития печени человека с помощью комбинации малых молекул и факторов роста9,10. Большинство протоколов состоят из ступенчатого процесса дифференциации, где гПСК загрунтуются до окончательной эндодермы, за которой следует спецификация печеночных прародителя11,12,13и заканчивающаяся спецификацией HLC. CLC, производимые этими протоколами, демонстрируют смесь фенотипов плода и взрослых. Это включает экспрессию альфа-фетопротеина (АФП), такого как маркеры гепатоцитов, такие как HNF4α и альбумин (ALB), а также метаболизирующая способность препарата14,15,16. Между лабораториями дифференциация ГЛК может варьироваться; поэтому необходима разработка стандартизированных протоколов. Это позволит исследователям эффективно генерировать и применять CLC, полученные из стволовых клеток, в больших масштабах для фундаментальных и клинических исследований.
Была разработана система дифференцировки печеночных прародителя, которая может быть применена как к эмбриональным, так и к индуцированным плюрипотентным линиям стволовых клеток с использованием простых в использовании руководящих принципов. Эта процедура дает однородные популяции печеночных прародителей в различных форматах культуры, начиная от колбы для клеточных культур до 96 пластин колодца. Ниже приведен протокол получения печеночных прародителей, полученных из стволовых клеток, в форматах 24 и 96 скважин.
Плотность ячеек, используемая в протоколе, представленном ниже, указана для одной скважины из 24 и 96 скважин соответственно (см. таблицу 1). Оптимизация начального номера ячейки требуется для различных форматов пластин клеточной культуры и клеточных линий. Рекомендуемая начальная плотность ячейки для оптимизации протокола составляет 2 x 105 ячеек/см2. Для оптимизации плотности можно проверить несколько плотностей ячеек, добавив ± 50 000 ячеек/см2 одновременно.
Генерация печеночных клеток-прародителя из плюрипотентных стволовых клеток в больших масштабах может представлять собой многообещающую альтернативу материалу, полученному из трупов. Стандартизация и воспроизводимость протоколов являются ключом к обеспечению трансляции технологий и воздействия на биомедицинские исследования. Для решения этой проблемы предыдущая работа была сосредоточена на разработке протокола поэтапной дифференциации от hESC и IPSCs с использованием определенных добавок и матриц15,23,24,25,26,27,28. Таким образом, фенотип гепатоцитов и воспроизводимость были улучшены, что позволило полуавтоматизировать процесс дифференцировки19. Представленная система усилена ее сочетанием с готовыми средами клеточных культур и легкой системой дифференцировки гепатоцитов.
Ранее плотность плюрипотентных клеток до начала протокола дифференцировки была выделена в качестве ключевой переменной для достижения однородной популяции печеночных клеток-прогениторов26. Используя эту более совершенную процедуру, можно генерировать большое количество печеночных прародителей, полученных из стволовых клеток, поэтапно, используя диапазон плотностей начальных клеток(таблица 1). На 5-й день окончательная индукция эндодермы была подтверждена окрашиванием Sox17(рисунок 3). Эффективная и надежная дифференциация в окончательную эндодерму была достигнута как с помощью испытанные линии ESC, так и с iPSC, причем более 80% экспрессировали Sox17(рисунок 3). На 10-й день печеночные прародители демонстрировали однородную булыжниковую морфологию, а маркеры стволовых клеток печени были высокообогащены как для AFP, так и для HNF4α (>86%, рисунок 4). Используя комбинацию ручных и полуавтоматических технологий, удалось выполнить дифференциацию в нескольких форматах пластин19.
В своей нынешней форме дифференцировка клеток подходит для экспериментов in vitro. Тем не менее, обогащение клеток, вероятно, потребуется перед клиническим применением, чтобы гарантировать, что однородная популяция печеночных прародителей подготовлена к доставке.
В заключение, протокол, описанный здесь, предоставляет области стандартизированный подход к производству печеночных прародителей в больших масштабах. Будущая работа будет сосредоточена на производстве новой среды для последующей дифференциации, созревания и обслуживания ГХЦ.
The authors have nothing to disclose.
Это исследование было поддержано наградами от MRC Doctoral Training Partnership (MR/K501293/1), Uk Regenerative Medicine Platform (MRC MR/L022974/1 и MR/K026666/1), Главного научного бюро (TCS/16/37).
DPBS with Calcium and Magnesium | ThermoFisher | 14040133 | |
Gentle cell dissociation reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | |
Hoechst 33342 Ready Flow Reagent | thermofisher | R37165 | |
Human Recombinant Laminin 521 | BioLamina | LN521-02 | |
Human Serum Albumin ELISA | Alpha Diagnostics | 1190 | |
Human Serum Alpha Fetoprotein ELISA | Alpha Diagnostics | 500 | |
mTeSR1 medium | STEMCELL Technologies | 5850 | |
Operetta High-Content Imaging System | PerkinElmer | HH12000000 | |
PBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14190250 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140122 | |
Rho-associated kinase (ROCK)inhibitor Y27632 | Sigma-Aldrich | Y0503-1MG | |
STEMdiff Definitive Endoderm Supplement CJ | STEMCELL Technologies | ||
STEMdiff Definitive Endoderm Supplement MR | STEMCELL Technologies | ||
STEMdiff Endoderm Basal Medium | STEMCELL Technologies | ||
STEMdiff Hepatic Progenitor Medium | STEMCELL Technologies | ||
TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
Antibodies | |||
Albumin | Sigma-Aldrich | A6684 | 1:200 (mouse) |
Alpha-fetoprotein | Sigma-Aldrich | A8452 | 1:400 (mouse) |
HNF-4α | Santa Cruz | sc-8987 | 1:400 (rabbit) |
IgG | DAKO | 1:400 | |
Sox17 | R&D Systems, Inc. | AF1924 | 1:200 (Goat) |
Software | |||
Columbus Image Data Storage and Analysis system | PerkinElmer |