Un protocolo mejorado para purificar y directamente monobiocalinato recombinante BDNF en un tubo para estudios de tráfico celular en neuronas
Summary
BDNF recombinante que contiene una secuencia Avi (BDNFAvi) se produce en células HEK293 de una manera rentable y se purifica mediante cromatografía de afinidad. BDNFavi es entonces directamente monobiontilado con la enzima BirA en un tubo. BDNFavi y BDNFavi monobionicionados conservan su actividad biológica en comparación con BDNF disponible comercialmente.
Abstract
BdNF recombinante que contiene una secuencia Avi (BDNFAvi) se produce en células HEK293 y luego se purifica de manera rentable mediante cromatografía de afinidad. Se desarrolló un protocolo reproducible para directamente el monobiotinilato BDNFAvi con la enzima BirA en un tubo. En esta reacción, el BDNFAvi monobionitilado conserva su actividad biológica.
Las neurotrofinas son factores de crecimiento derivados de objetivos que juegan un papel en el desarrollo y mantenimiento neuronal. Requieren mecanismos de transporte rápido a lo largo de la vía endocítica para permitir la señalización de larga distancia entre diferentes compartimentos neuronales. El desarrollo de herramientas moleculares para estudiar el tráfico de neurotrofinas ha permitido el seguimiento preciso de estas proteínas en la célula utilizando la grabación in vivo. En este protocolo, desarrollamos un procedimiento optimizado y rentable para la producción de BDNF monobionitilado. Una variante BDNF recombinante que contiene una secuencia avi biotinipilable (BDNFAvi) se produce en células HEK293 en el rango de microgramos y luego se purifica en un procedimiento fácilmente escalable utilizando cromatografía de afinidad. El BDNF purificado puede ser homogéneamente monobioniizado por una reacción in vitro directa con la enzima BirA en un tubo. La actividad biológica del BDNF monobiotinilado (mbtBDNF) se puede conjugar con estreptavidina conjugada con diferentes fluoróforos. BDNFAvi y mbtBDNF conservan su actividad biológica demostrada mediante la detección de objetivos fosforilados aguas abajo utilizando la mancha occidental y la activación del factor de transcripción CREB, respectivamente. Usando puntos estreptavidina-cuánticos, pudimos visualizar la internalización mbtBDNF concomitante con la activación de CREB, que se detectó con un anticuerpo específico fosfo-CREB. Además, mbtBDNF conjugado con puntos estreptavidina-cuánticos era adecuado para el análisis de transporte retrógrado en neuronas corticales cultivadas en cámaras microfluídicas. Por lo tanto, en tubo producido mbtBDNF es una herramienta fiable para estudiar la señalización fisiológica dinámica endosome y el tráfico de neuronas.
Introduction
Las neuronas son las unidades funcionales del sistema nervioso que poseen una morfología compleja y especializada que permite la comunicación sináptica, y por lo tanto, la generación de comportamiento coordinado y complejo en respuesta a diversos estímulos. Las proyecciones neuronales como las dendritas y los axones son características estructurales críticas implicadas en la comunicación neuronal, y las neurotrofinas son actores cruciales para determinar su morfología y función1. Las neurotrofinas son una familia de factores de crecimiento secretados que incluyen NGF, NT-3, NT-4 y factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF)2. En el sistema nervioso central (CNS), BDNF participa en diversos procesos biológicos incluyendo neurotransmisión, arborización dendrítica, maduración de espinas dendríticas, potenciación a largo plazo, entre otros3,,4. Por lo tanto, BDNF desempeña un papel crítico en la regulación de la función neuronal.
Diversos procesos celulares regulan la dinámica y la función de BDNF. En la superficie neuronal, BDNF une la quinasa del receptor de tropomiosina B (TrkB) y/o el receptor de neurotrofina p75 (p75). Los complejos BDNF-TrkB y BDNF-p75 están endocytosed y ordenados en diferentes orgánulos endocíticos5,6,7,8. Se requiere un tráfico intracelular correcto del complejo BDNF/TrkB para la señalización adecuada de BDNF en diferentes circuitos neuronales9,10,11. Por esta razón, una comprensión profunda de la dinámica de tráfico de BDNF y sus alteraciones encontradas en los procesos fisiopatológicos es esencial para entender la señalización de BDNF en la salud y la enfermedad. El desarrollo de herramientas moleculares novedosas y específicas para monitorear este proceso ayudará a impulsar este campo y permitirá una mejor comprensión de los mecanismos regulatorios involucrados.
Hay varias herramientas disponibles para el estudio del tráfico de BDNF en las neuronas. Una metodología de uso común implica la transfección de BDNF recombinante etiquetado con moléculas fluorescentes como la proteína fluorescente verde (GFP) o la variante monomérica fluorescente desplazada en rojo de GFP mCherry12,13. Sin embargo, una deficiencia importante de la sobreexpresión de BDNF es que elimina la posibilidad de entregar concentraciones conocidas de esta neurotrofina. También, puede resultar en toxicidad celular, oscureciendo la interpretación de los resultados14. Una estrategia alternativa es la transfección de un TrkB con etiqueta de epítopo, como Flag-TrkB. Esta metodología permite el estudio de la dinámica de internalización TrkB15,pero también implica transfección, que podría resultar en la alteración de la función TrkB y toxicidad celular. Para superar estos obstáculos metodológicos, se desarrollaron variantes recombinantes de NGF y BDNF que contienen una secuencia Avi (BDNFAvi), que pueden ser monobiocrizadas por la enzima biotina-ligasa BirA,16,17. El BDNF recombinante biotinilado se puede acoplar a diferentes herramientas unidas a estreptavidina, que incluyen fluoróforos, perlas, nanopartículas paramagnéticas entre otras para su detección. En términos de imágenes de células vivas, los puntos cuánticos (QD) se han convertido en fluoróforos de uso frecuente, ya que tienen características deseables para el seguimiento de una sola partícula, como el aumento del brillo y la resistencia al fotoblanqueo en comparación con los fluoróforos de moléculas pequeñas18.
La producción de BDNF monobiocrílico (mbtBDNF) utilizando BDNFAvi se ha logrado mediante la co-transfección de plásmidos que impulsan la expresión de BDNFAvi y BirA, seguida de la purificación de la proteína recombinante por17cromatografía de afinidad con un rendimiento de 1-2 g de BDNF por 20 mL de HEK293- Aquí, proponemos una modificación de este protocolo que permite la purificación DE BDNFAvi a partir de 500 ml de medios condicionados por HEK293, que busca maximizar la recuperación de proteínas en un protocolo basado en cromatografía-columna para facilitar la manipulación. El agente de transfección utilizado, la polietilenimina (PEI), garantiza un método rentable sin sacrificar el rendimiento de la transfección. La etapa de monobiocriilación se ha adaptado a una reacción in vitro para evitar las complicaciones asociadas con las co-transfecciones y para garantizar un etiquetado homogéneo de BDNF. La actividad biológica del mbtBDNF fue demostrada por experimentos de microscopía de borla occidental y fluorescencia, incluyendo la activación de pCREB y la imagen de células vivas para estudiar el transporte axonal retrógrado de BDNF en cámaras microfluídicas. El uso de este protocolo permite una producción optimizada y de alto rendimiento de BDNF homogénea monobionitilada y biológicamente activa.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este artículo, se describe una metodología optimizada para la producción y purificación de mbtBDNF en un procedimiento basado en cromatografía de afinidad, basada en el trabajo de Sung y colaboradores17. Las optimizaciones incluyen el uso de un reactivo de transfección (PEI) rentable mientras se mantiene la eficiencia de métodos de transfección más caros como la lipofectamina. Esta optimización se traduce en una reducción significativa de los costos en el protocolo, lo que permite la…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen el apoyo financiero de Fondecyt (1171137) (FCB), el Centro Basal de Excelencia en Ciencia y Tecnología (AFB 170005) (FCB), Millenium-Nucleus (P (FCB), el Wellcome Trust Senior Investigator Award (107116/Z/15/Z) (GS) y un premio de la Fundación del Instituto de Investigación de la Demencia del Reino Unido (GS). Este trabajo fue apoyado por la Unidad de Microscopía Avanzada UC (UMA UC).
Materials
| 2 way stopcock | BioRad | 7328102 | Chromatography apparatus component |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | BDNF elution buffer |
| Acrylamide/Bisacrylamide | BioRad | 1610154 | SDS-PAGE gel preparation |
| Amicon Ultra-15 10K | Millipore | UFC901024 | BDNF concentration |
| Ammonium Persulfate | Sigma | A9164 | SDS-PAGE gel preparation |
| anti B-III-Tubulin antibody | Sigma | T8578 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti BDNF antibody | Alomone | AGP-021 | Western blot assays for BDNF quantification |
| anti BDNF antibody | Alomone | ANT-010 | Western blot assays for BDNF quantification |
| Anti ERK antibody | Cell Signaling | 9102 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti pCREB antibody (S133) | Cell Signaling | 9198 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti pERK antibody (T202, Y204) | Cell Signaling | 4370 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti pTrkB antibody (Y515) | Abcam | ab109684 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| Antibiotic/Antimycotic | Gibco | 15240-062 | HEK293 maintenance |
| ATP | Sigma | A26209 | BDNF monobiotinylation buffer |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504-044 | Neuron maintenance |
| Bicine | Sigma | B3876 | BDNF monobiotinylation buffer |
| BirA-GST | BPS Bioscience | 70031 | Enzyme for BDNF AviTag monobiotinylation |
| Bovine Fetal Serum | HyClone | HC.SH30396.02 | HEK293 maintenance |
| Bovine Serum Albumin | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | BDNF buffer modification component, blocking buffer for western blot and immunofluorescence |
| D-Biotin | Sigma | B4639 | BDNF monobiotinylation buffer |
| Dithiothreitol | Invitrogen | 15508-013 | |
| DMEM High Glucose Medium | Gibco | 11965-092 | Neuron seeding |
| DMEM Medium | Gibco | 11995-081 | HEK293 maintenance |
| Econo Column Funnel | BioRad | 7310003 | Chromatography apparatus component |
| EDTA | Merck | 108418 | |
| EZ-ECL Kit | Biological Industries | 1633664 | Protein detection by western blotting |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | Neuron and HEK293 maintenance |
| Glycerol | Merck | 104094 | BDNF elution buffer, lysis buffer for western blot assays |
| Hettich Rotina 46R Centrifuge | Hettich | Discontinued | Centrifuge used for clearing the medium of debris |
| Hettich Universal 32R Centrifuge | Hettich | Discontinued | Centrifuge used for protein concentrator centrifugation |
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | Neuron seeding |
| ImageQuant LAS 500 | GE Healthcare Life Sciences | 29005063 | Western blot image acquisition |
| Imidazole | Sigma | I55513 | BDNF buffer modification component |
| KCl | Winkler | BM-1370 | PBS component |
| KH2PO4 | Merck | 104873 | PBS component |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | Cover coating for compartmentalized neurons |
| Luer Tubing Adaptor | BioRad | 7323245 | Chromatography apparatus component |
| Luminata™ Forte Western HRP Substrate | Millipore | WBLUF0100 | Protein detection by western blotting |
| Mg(CH3COO)2 | Merck | 105819 | BDNF monobiotinylation buffer |
| Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | Mounting reagent for immunofluorescence assays |
| MyOne C1 Streptavidin Magnetic Beads | Invitrogen | 65001 | Biotinylation verification |
| Na2HPO4 | Merck | 106586 | BDNF buffer modification component |
| NaCl | Winkler | BM-1630 | PBS component, BDNF buffer modification component |
| NaH2PO4 | Merck | 106346 | BDNF buffer modification component |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | Neuron maintenance |
| Ni-NTA Agarose Beads | Qiagen | 30210 | BDNF AviTag purification |
| Nikon Ti2-E | Nikon | Microscope for fluorescence imaging | |
| Nitrocellulose Membrane | BioRad | 1620115 | Protein transfer for western blotting |
| ORCA-Flash4.0 V3 Digital CMOS camera | Hamamatsu | C13440-20CU | Camera for epifluorescence imaging |
| P8340 Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | P8340 | BDNF buffer modification component |
| Paraformaldehyde | Merck | 104005 | Fixative for immunofluorescence assays |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Neuron maintenance |
| Poli-D-Lysine | Corning | DLW354210 | Cover coating for compartmentalized neurons |
| Poli-L-Lysine | Millipore | P2363 | Cover coating for non-compartmentalized neurons |
| Poly-Prep Chromatography Column | BioRad | 7311550 | Chromatography apparatus component |
| Polyethyleneimine 25K | Polysciences Inc. | PLY-0296 | HEK293 transfection |
| Quantum Dots 655 streptavidin conjugate | Invitrogen | Q10121MP | Monobiotinylated BDNF AviTag label for live and fixed cell experiments |
| Saponin | Sigma | S4521 | Detergent for immunofluorescence assays |
| Sucrose | Merck | 107687 | |
| Syldgard 184 silicone elastomer base | Poirot | 4019862 | Microfluidic chamber preparation |
| TEMED | Sigma | T9281 | SDS-PAGE gel preparation |
| Tris | Winkler | BM-2000 | Lysis buffer component |
| Triton X100 | Merck | 108603 | Cell permeabilization in immunofluorescence and western blot assays |
| Trypsin-EDTA 0.5% | Gibco | 15400-054 | HEK293 passaging |
Referências
- Huang, E., Reichardt, L. Neurotrophins: Roles in Neuronal Development and Function. Annual Review of Neuroscience. 24, 677-736 (2001).
- Skaper, S. D. The neurotrophin family of neurotrophic factors: an overview. Methods in Mollecular Biology. 846, 1-12 (2012).
- Gonzalez, A., Moya-Alvarado, G., Gonzalez-Billault, C., Bronfman, F. C. Cellular and molecular mechanism regulating neuronal growth by brain-derived neurotrophic factor. Cytoskeleton. 73 (10), 612-628 (2016).
- Cunha, C., Brambilla, R., Thomas, K. A simple role for BDNF in learning and memory. Frontiers in Mollecular Neuroscience. 3, 1 (2010).
- Bronfman, F. C., Lazo, O. M., Flores, C., Escudero, C. A., Lewin, G., Carter, B. Spatiotemporal intracelular dynamics of neurotrophin and its receptors. Implications for neurotrophin signaling and neuronal function. Neurotrophic Factor. Handbook of Experimental Pharmacology. 220, (2014).
- Ascano, M., Bodmer, D., Kuruvilla, R. Endocytic trafficking of neurotrophins in neural development. Trends in Cell Biology. 22 (5), 266-273 (2012).
- Deinhardt, K., Salinas, S., Verastegui, C., Watson, R., Worth, D., Hanrahan, S., Bucci, C., Schiavo, G. Rab5 and Rab7 control endocytic sorting along the axonal retrograde transport pathway. Neuron. 52 (2), 293 (2006).
- Escudero, C. A., et al. c-Jun N-terminal kinase (JNK)-dependent internalization and Rab5-dependent endocytic sorting medaited long-distance retrograde neuronal death induced by axonal BDNF-p75 signaling. Scientific Reports. 9, 6070 (2019).
- Vrabec, J. P., Levin, L. A. The neurobiology of cell death in glaucoma. Eye. 21, 11-14 (2007).
- Liot, G., Zala, D., Pla, P., Mottet, G., Piel, M., Saudou, F. Mutant huntingtin alters retrograde transport of TrkB receptors in striatal dendrites. Journal of Neuroscience. 33 (15), 6298-6309 (2013).
- Zhou, B., Cai, Q., Xie, Y., Sheng, Z. H. Snapin recruits dynein to BDNF-TrkB signaling endosomes for retrograde axonal transport and is essential for dendrite growth of cortical neurons. Cell Reports. 2 (1), 42-51 (2012).
- Haubensak, W., Narz, F., Heumann, R., Lessmann, V. BDNF-GFP containing secretory granules are localized in the vicinity of synaptic junctions of cultured cortical neurons. Journal of Cell Science. 111 (11), 1483-1493 (1998).
- Adachi, N., et al. Glucocorticoid affects dendritic transport of BDNF-containing vesicles. Scientific Reports. 5, 12684 (2015).
- Biocompare: The Buyer’s Guide for Life Scientists. Mirus Bio. Cellular Toxicity Caused by Transfection: Why is it important Available from: https://www.biocompare.com/Bench-Tips/121111-Cellular-Toxicity-Caused-by-Transfection-Why-is-it-important/ (2012)
- Zhao, L., et al. Mechanism underlying activity-dependent insertion of TrkB into the neuronal surface. Journal of Cell Science. 122 (17), 3123-3136 (2009).
- Zhao, X., Zhou, Y., Weissmiller, A., Pearn, M., Mobley, W., Wu, C. Real-time imaging of axonal transport of quantum dot-labeled BDNF in primary neurons. Journal of Visualized Experiments. 91, 51899 (2014).
- Sung, K., Maloney, M., Yang, J., Wu, C. A novel method for producing mono-biotinylated, biologically active neurotrophic factors: an essential reagent for single molecule study of axonal transport. Journal of Neuroscience Methods. 200 (2), 121-128 (2011).
- Deerinck, T. The application of fluorescent quantum dots to confocal, multiphoton and electron microscopic imaging. Toxicologic Pathology. 36 (1), 112-116 (2008).
- Unsain, N., Nuñez, N., Anastasia, A., Mascó, D. H. Status epilepticus induces a TrkB to p75 neurotrophin receptor switch and increases brain-derived neurotrophic factor interaction with p75 neurotrophon receptor: an initial event in neuronal injury induction. Neurociência. 154 (3), 978-993 (2008).
- Walker, J. M. The bicinchoninic acid (BCA) assay for protein quantitation. Methods Mol Biol. 32, 5-8 (1994).
- Moya-Alvarado, G., Gonzalez, A., Stuardo, N., Bronfman, F. C. Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) regulates Rab5-positive early endosomes in hippocampal neurons to induce dendritic branching. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 493 (2018).
- Sasi, M., Vignoli, B., Canossa, M., Blum, R. Neurobiology of local and intercellular BDNF signaling. Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 469 (5), 593-610 (2017).
- . The Rab5-Rab11 endosomal pathway is required for BDNF-induced CREB transcriptional regulation in neurons Available from: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/844720v1 (2019)
- Mowla, , et al. Biosynthesis and post-translational processing of the precursor to brain-derived neurotrophic factor. Journal of Biological Chemistry. 276 (16), 12660-12666 (2001).
- Longo, P., Kavran, J., Kim, M. S., Leahy, D. Transient Mammalian Cell Transfection with Polyethyleneimine (PEI). Methods in Enzymology. 529, 227-240 (2013).
- Raymond, C., Tom, R., Perret, S., Moussouami, P., L’Abbé, D., St-Laurent, G., Durocher, Y. A simplified polyethyleneimine-mediated transfection process for large-scale and high-throughput applications. Methods. 55 (1), 44-51 (2011).
- Dalton, A., Barton, W. Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines. Protein Science. 23 (5), 517-525 (2014).
- Hunter, M., Yuan, P., Vavilala, D., Fox, M. Optimization of protein expression in mammalian cells. Current Protocols in Protein Science. 95 (1), 77 (2019).
- Stepanenko, A. A., Heng, H. H. Transient and stable vector transfection: Pitfalls, off-target effects, artifacts. Mutation Research. 773, 91-103 (2017).
- Guerzoni, L. P., Nicolas, V., Angelova, A. In vitro modulation of TrkB receptor signaling upon sequential delivery of curcumin-DHA loaded carriers towards promoting neuronal survival. Pharmaceutical Research. 34 (2), 492-505 (2017).
- Angelova, A., Angelov, B. Dual and multi-drug delivery nanoparticles towards neuronal survival and synaptic repair. Neural Regeneration Research. 12 (6), 886-889 (2017).
