Ett förbättrat protokoll för att rena och direkt monobiotinylat Rekombinant BDNF i ett rör för cellulära människohandel studier i nervceller
Summary
Rekombinant BDNF som innehåller en Avi-sekvens (BDNFAvi) produceras i HEK293-celler på ett kostnadseffektivt sätt och renas genom affinitetkromatografi. BDNFavi är därefter direkt mono-biotinylated med enzymet BirA i ett rör. BDNFavi och monobiotinylerade BDNFavi behåller sin biologiska aktivitet jämfört med kommersiellt tillgängliga BDNF.
Abstract
Rekombinant BDNF som innehåller en Avi-sekvens (BDNFAvi) produceras i HEK293-celler och renas sedan kostnadseffektivt genom affinitetkromatografi. Ett reproducerbart protokoll utvecklades för att direkt mono-biotinylate BDNFAvi med enzymet BirA i ett rör. I denna reaktion behåller monobiotinylerade BDNFAvi sin biologiska aktivitet.
Neurotrophins är mål-härledda tillväxtfaktorer spelar en roll i neuronal utveckling och underhåll. De kräver snabba transportmekanismer längs den endocytiska vägen för att tillåta långväga signalering mellan olika neuronala avdelningar. Utvecklingen av molekylära verktyg för att studera handeln med neurotroféer har möjliggjort exakt spårning av dessa proteiner i cellen med hjälp av in vivo-registrering. I detta protokoll utvecklade vi ett optimerat och kostnadseffektivt förfarande för produktion av monobiotinylerad BDNF. En rekombinant BDNF-variant som innehåller en biotinylable avi-sekvens (BDNFAvi) produceras i HEK293-celler i mikrogramområdet och renas sedan i ett lätt skalbart förfarande med affinitetskromatografi. Den renade BDNF kan sedan homogent mono-biotinyleras genom en direkt in vitro-reaktion med enzymet BirA i ett rör. Den biologiska aktiviteten hos den monobiotinylerade BDNF (mbtBDNF) kan konjugeras till streptavidin-konjugerade till olika fluorofores. BDNFAvi och mbtBDNF behåller sin biologiska aktivitet som påvisas genom detektion av fosforylerade mål nedströms med hjälp av västra blot respektive aktivering av transkriptionsfaktorn CREB. Med hjälp av streptavidin-quantum prickar, kunde vi visualisera mbtBDNF internalisering samtidigt med aktivering av CREB, som upptäcktes med en phospho-CREB specifik antikropp. Dessutom mbtBDNF konjugerade till streptavidin-quantum prickar var lämplig för bakåtsträvande transport analys i när nervceller odlas i mikrofluidiska kammare. Således, i röret produceras MBTBDNF är ett tillförlitligt verktyg för att studera fysiologiska signalering endosome dynamik och handel med nervceller.
Introduction
Nervceller är de funktionella enheterna i nervsystemet som har en komplex och specialiserad morfologi som tillåter synaptisk kommunikation, och därmed, generering av samordnade och komplexa beteende som svar på olika stimuli. Neuronala projektioner som dendriter och axoner är kritiska strukturella funktioner som är involverade i neuronal kommunikation, och neurotrophins är avgörande aktörer för att bestämma deras morfologi och funktion1. Neurotroferna är en familj av utsöndrade tillväxtfaktorer som inkluderar NGF, NT-3, NT-4, och hjärnan-härledda neurotrofisk faktor (BDNF)2. I det centrala nervsystemet (CNS), BDNF deltar i olika biologiska processer inklusive neurotransmission, dendritisk arborization, mognad av dendritiska taggar, långsiktig potentiering, bland annat3,4. Därför spelar BDNF en avgörande roll i regleringen av neuronal funktion.
Olika cellulära processer reglerar BDNF dynamik och funktion. På den neuronala ytan binder BDNF tropomyosinreceptorkinesen B (TrkB) och/eller p75 neurotrofilceptorn (p75). Komplexen BDNF-TrkB och BDNF-p75 är endocytosed och sorterade i olika endocytiska organeller5,,6,7,8. Korrekt intracellulär handel med BDNF/TrkB-komplexet krävs för korrekt BDNF-signalering i olika neuronala kretsar9,10,11. Av denna anledning är en djup förståelse av BDNF människohandel dynamik och dess förändringar som finns i patofysiologiska processer viktigt att förstå BDNF signalering i hälsa och sjukdom. Utvecklingen av nya och specifika molekylära verktyg för att övervaka denna process kommer att bidra till att driva detta område framåt och möjliggöra ett bättre grepp om de berörda regleringsmekanismerna.
Det finns flera verktyg tillgängliga för studier av BDNF handel med nervceller. En vanlig metod innebär transfection av rekombinanta BDNF märkta med fluorescerande molekyler såsom grönt fluorescerande protein (GFP) eller den monomeriska fluorescerande rödförskjutna varianten av GFP mCherry12,13. En stor brist i BDNF överuttryck är dock att det eliminerar möjligheten att leverera kända koncentrationer av denna neurotrotroin. Det kan också resultera i cellulär toxicitet, dölja tolkningen av resultat14. En alternativ strategi är transfection av en epitop-märkt TrkB, såsom Flag-TrkB. Denna metod möjliggör studiet av TrkB internalisering dynamik15, men det innebär också transfection, vilket kan resultera i förändrad TrkB funktion och cellulär toxicitet. För att övervinna dessa metodologiska hinder utvecklades rekombinanta varianter av NGF och BDNF som innehåller en Avi-sekvens (BDNFAvi), som kan vara monobiotinylerat av biotinligasenzymet BirA,16,17. Biotinylated recombinant BDNF kan kopplas till olika streptavidin-bundna verktyg, som inkluderar fluorofores, pärlor, paramagnetiska nanopartiklar bland annat för detektion. När det gäller live-cell imaging, kvantprickar (QD) har blivit ofta används fluorofores, eftersom de har önskvärda egenskaper för enpartikel spårning, såsom ökad ljusstyrka och motståndskraft mot fotobleaching jämfört med små molekyl fluorofores18.
Produktionen av monobiotinylerad BDNF (mbtBDNF) med BDNFAvi har uppnåtts genom samtransfekt av plasmider som driver uttrycket av BDNFAvi och BirA. följt av rening av det rekombinanta proteinet genom affinitetkromatografi med en avkastning på 1-2 μg BDNF per 20 ml HEK293-konditionerad kulturmedia17. Här föreslår vi en ändring av detta protokoll som möjliggör BDNFAvi rening från 500 ml HEK293-konditionerade medier, som syftar till att maximera proteinåtervinning i en kromatografi-kolumn baserat protokoll för enkel manipulation. Det använda transfectionmedlet, polyetenimin (PEI), säkerställer en kostnadseffektiv metod utan att offra transfection avkastning. Monobiotinylationssteget har anpassats till en in vitro-reaktion för att undvika komplikationer i samband med co-transfections och för att säkerställa homogen märkning av BDNF. Den biologiska aktiviteten hos mbtBDNF visades av västra blot och fluorescensmikroskopi experiment, inklusive aktivering av pCREB och levande cell imaging att studera bakåtsträvande axonal transport av BDNF i mikrofluidiska kammare. Användningen av detta protokoll möjliggör optimerad, hög avkastning produktion av homogen mono-biotinylerade och biologiskt aktiva BDNF.
Protocol
Representative Results
Discussion
I den här artikeln beskrivs en optimerad metod för produktion och rening av mbtBDNF i en affinitetkromatografibaserad procedur, baserad på Sungs och medarbetares arbete17. Optimeringarna omfattar användning av ett kostnadseffektivt transfection reagens (PEI) samtidigt som effektiviteten i dyrare transfection metoder såsom lipofectamin. Den här optimeringen leder till en betydande kostnadsminskning i protokollet, vilket möjliggör skalbarhet samtidigt som hög kostnadseffektivitet bibehålls…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna erkänner tacksamt ekonomiskt stöd från Fondecyt (1171137) (FCB), Basal Center of Excellence in Science and Technology (AFB 170005) (FCB), Millenium-Nucleus (P07/011-F) (FCB), Wellcome Trust Senior Investigator Award (107116/Z/15/Z) (GS) och ett brittiskt pris för Dementia Research Institute Foundation (GS). Detta arbete stöddes av Unidad de Microscopía Avanzada UC (UMA UC).
Materials
| 2 way stopcock | BioRad | 7328102 | Chromatography apparatus component |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | BDNF elution buffer |
| Acrylamide/Bisacrylamide | BioRad | 1610154 | SDS-PAGE gel preparation |
| Amicon Ultra-15 10K | Millipore | UFC901024 | BDNF concentration |
| Ammonium Persulfate | Sigma | A9164 | SDS-PAGE gel preparation |
| anti B-III-Tubulin antibody | Sigma | T8578 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti BDNF antibody | Alomone | AGP-021 | Western blot assays for BDNF quantification |
| anti BDNF antibody | Alomone | ANT-010 | Western blot assays for BDNF quantification |
| Anti ERK antibody | Cell Signaling | 9102 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti pCREB antibody (S133) | Cell Signaling | 9198 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti pERK antibody (T202, Y204) | Cell Signaling | 4370 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| anti pTrkB antibody (Y515) | Abcam | ab109684 | Western blot assays for BDNF biological activity detection |
| Antibiotic/Antimycotic | Gibco | 15240-062 | HEK293 maintenance |
| ATP | Sigma | A26209 | BDNF monobiotinylation buffer |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504-044 | Neuron maintenance |
| Bicine | Sigma | B3876 | BDNF monobiotinylation buffer |
| BirA-GST | BPS Bioscience | 70031 | Enzyme for BDNF AviTag monobiotinylation |
| Bovine Fetal Serum | HyClone | HC.SH30396.02 | HEK293 maintenance |
| Bovine Serum Albumin | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | BDNF buffer modification component, blocking buffer for western blot and immunofluorescence |
| D-Biotin | Sigma | B4639 | BDNF monobiotinylation buffer |
| Dithiothreitol | Invitrogen | 15508-013 | |
| DMEM High Glucose Medium | Gibco | 11965-092 | Neuron seeding |
| DMEM Medium | Gibco | 11995-081 | HEK293 maintenance |
| Econo Column Funnel | BioRad | 7310003 | Chromatography apparatus component |
| EDTA | Merck | 108418 | |
| EZ-ECL Kit | Biological Industries | 1633664 | Protein detection by western blotting |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | Neuron and HEK293 maintenance |
| Glycerol | Merck | 104094 | BDNF elution buffer, lysis buffer for western blot assays |
| Hettich Rotina 46R Centrifuge | Hettich | Discontinued | Centrifuge used for clearing the medium of debris |
| Hettich Universal 32R Centrifuge | Hettich | Discontinued | Centrifuge used for protein concentrator centrifugation |
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | Neuron seeding |
| ImageQuant LAS 500 | GE Healthcare Life Sciences | 29005063 | Western blot image acquisition |
| Imidazole | Sigma | I55513 | BDNF buffer modification component |
| KCl | Winkler | BM-1370 | PBS component |
| KH2PO4 | Merck | 104873 | PBS component |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | Cover coating for compartmentalized neurons |
| Luer Tubing Adaptor | BioRad | 7323245 | Chromatography apparatus component |
| Luminata™ Forte Western HRP Substrate | Millipore | WBLUF0100 | Protein detection by western blotting |
| Mg(CH3COO)2 | Merck | 105819 | BDNF monobiotinylation buffer |
| Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | Mounting reagent for immunofluorescence assays |
| MyOne C1 Streptavidin Magnetic Beads | Invitrogen | 65001 | Biotinylation verification |
| Na2HPO4 | Merck | 106586 | BDNF buffer modification component |
| NaCl | Winkler | BM-1630 | PBS component, BDNF buffer modification component |
| NaH2PO4 | Merck | 106346 | BDNF buffer modification component |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | Neuron maintenance |
| Ni-NTA Agarose Beads | Qiagen | 30210 | BDNF AviTag purification |
| Nikon Ti2-E | Nikon | Microscope for fluorescence imaging | |
| Nitrocellulose Membrane | BioRad | 1620115 | Protein transfer for western blotting |
| ORCA-Flash4.0 V3 Digital CMOS camera | Hamamatsu | C13440-20CU | Camera for epifluorescence imaging |
| P8340 Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | P8340 | BDNF buffer modification component |
| Paraformaldehyde | Merck | 104005 | Fixative for immunofluorescence assays |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Neuron maintenance |
| Poli-D-Lysine | Corning | DLW354210 | Cover coating for compartmentalized neurons |
| Poli-L-Lysine | Millipore | P2363 | Cover coating for non-compartmentalized neurons |
| Poly-Prep Chromatography Column | BioRad | 7311550 | Chromatography apparatus component |
| Polyethyleneimine 25K | Polysciences Inc. | PLY-0296 | HEK293 transfection |
| Quantum Dots 655 streptavidin conjugate | Invitrogen | Q10121MP | Monobiotinylated BDNF AviTag label for live and fixed cell experiments |
| Saponin | Sigma | S4521 | Detergent for immunofluorescence assays |
| Sucrose | Merck | 107687 | |
| Syldgard 184 silicone elastomer base | Poirot | 4019862 | Microfluidic chamber preparation |
| TEMED | Sigma | T9281 | SDS-PAGE gel preparation |
| Tris | Winkler | BM-2000 | Lysis buffer component |
| Triton X100 | Merck | 108603 | Cell permeabilization in immunofluorescence and western blot assays |
| Trypsin-EDTA 0.5% | Gibco | 15400-054 | HEK293 passaging |
Referências
- Huang, E., Reichardt, L. Neurotrophins: Roles in Neuronal Development and Function. Annual Review of Neuroscience. 24, 677-736 (2001).
- Skaper, S. D. The neurotrophin family of neurotrophic factors: an overview. Methods in Mollecular Biology. 846, 1-12 (2012).
- Gonzalez, A., Moya-Alvarado, G., Gonzalez-Billault, C., Bronfman, F. C. Cellular and molecular mechanism regulating neuronal growth by brain-derived neurotrophic factor. Cytoskeleton. 73 (10), 612-628 (2016).
- Cunha, C., Brambilla, R., Thomas, K. A simple role for BDNF in learning and memory. Frontiers in Mollecular Neuroscience. 3, 1 (2010).
- Bronfman, F. C., Lazo, O. M., Flores, C., Escudero, C. A., Lewin, G., Carter, B. Spatiotemporal intracelular dynamics of neurotrophin and its receptors. Implications for neurotrophin signaling and neuronal function. Neurotrophic Factor. Handbook of Experimental Pharmacology. 220, (2014).
- Ascano, M., Bodmer, D., Kuruvilla, R. Endocytic trafficking of neurotrophins in neural development. Trends in Cell Biology. 22 (5), 266-273 (2012).
- Deinhardt, K., Salinas, S., Verastegui, C., Watson, R., Worth, D., Hanrahan, S., Bucci, C., Schiavo, G. Rab5 and Rab7 control endocytic sorting along the axonal retrograde transport pathway. Neuron. 52 (2), 293 (2006).
- Escudero, C. A., et al. c-Jun N-terminal kinase (JNK)-dependent internalization and Rab5-dependent endocytic sorting medaited long-distance retrograde neuronal death induced by axonal BDNF-p75 signaling. Scientific Reports. 9, 6070 (2019).
- Vrabec, J. P., Levin, L. A. The neurobiology of cell death in glaucoma. Eye. 21, 11-14 (2007).
- Liot, G., Zala, D., Pla, P., Mottet, G., Piel, M., Saudou, F. Mutant huntingtin alters retrograde transport of TrkB receptors in striatal dendrites. Journal of Neuroscience. 33 (15), 6298-6309 (2013).
- Zhou, B., Cai, Q., Xie, Y., Sheng, Z. H. Snapin recruits dynein to BDNF-TrkB signaling endosomes for retrograde axonal transport and is essential for dendrite growth of cortical neurons. Cell Reports. 2 (1), 42-51 (2012).
- Haubensak, W., Narz, F., Heumann, R., Lessmann, V. BDNF-GFP containing secretory granules are localized in the vicinity of synaptic junctions of cultured cortical neurons. Journal of Cell Science. 111 (11), 1483-1493 (1998).
- Adachi, N., et al. Glucocorticoid affects dendritic transport of BDNF-containing vesicles. Scientific Reports. 5, 12684 (2015).
- Biocompare: The Buyer’s Guide for Life Scientists. Mirus Bio. Cellular Toxicity Caused by Transfection: Why is it important Available from: https://www.biocompare.com/Bench-Tips/121111-Cellular-Toxicity-Caused-by-Transfection-Why-is-it-important/ (2012)
- Zhao, L., et al. Mechanism underlying activity-dependent insertion of TrkB into the neuronal surface. Journal of Cell Science. 122 (17), 3123-3136 (2009).
- Zhao, X., Zhou, Y., Weissmiller, A., Pearn, M., Mobley, W., Wu, C. Real-time imaging of axonal transport of quantum dot-labeled BDNF in primary neurons. Journal of Visualized Experiments. 91, 51899 (2014).
- Sung, K., Maloney, M., Yang, J., Wu, C. A novel method for producing mono-biotinylated, biologically active neurotrophic factors: an essential reagent for single molecule study of axonal transport. Journal of Neuroscience Methods. 200 (2), 121-128 (2011).
- Deerinck, T. The application of fluorescent quantum dots to confocal, multiphoton and electron microscopic imaging. Toxicologic Pathology. 36 (1), 112-116 (2008).
- Unsain, N., Nuñez, N., Anastasia, A., Mascó, D. H. Status epilepticus induces a TrkB to p75 neurotrophin receptor switch and increases brain-derived neurotrophic factor interaction with p75 neurotrophon receptor: an initial event in neuronal injury induction. Neurociência. 154 (3), 978-993 (2008).
- Walker, J. M. The bicinchoninic acid (BCA) assay for protein quantitation. Methods Mol Biol. 32, 5-8 (1994).
- Moya-Alvarado, G., Gonzalez, A., Stuardo, N., Bronfman, F. C. Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) regulates Rab5-positive early endosomes in hippocampal neurons to induce dendritic branching. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 493 (2018).
- Sasi, M., Vignoli, B., Canossa, M., Blum, R. Neurobiology of local and intercellular BDNF signaling. Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 469 (5), 593-610 (2017).
- . The Rab5-Rab11 endosomal pathway is required for BDNF-induced CREB transcriptional regulation in neurons Available from: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/844720v1 (2019)
- Mowla, , et al. Biosynthesis and post-translational processing of the precursor to brain-derived neurotrophic factor. Journal of Biological Chemistry. 276 (16), 12660-12666 (2001).
- Longo, P., Kavran, J., Kim, M. S., Leahy, D. Transient Mammalian Cell Transfection with Polyethyleneimine (PEI). Methods in Enzymology. 529, 227-240 (2013).
- Raymond, C., Tom, R., Perret, S., Moussouami, P., L’Abbé, D., St-Laurent, G., Durocher, Y. A simplified polyethyleneimine-mediated transfection process for large-scale and high-throughput applications. Methods. 55 (1), 44-51 (2011).
- Dalton, A., Barton, W. Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines. Protein Science. 23 (5), 517-525 (2014).
- Hunter, M., Yuan, P., Vavilala, D., Fox, M. Optimization of protein expression in mammalian cells. Current Protocols in Protein Science. 95 (1), 77 (2019).
- Stepanenko, A. A., Heng, H. H. Transient and stable vector transfection: Pitfalls, off-target effects, artifacts. Mutation Research. 773, 91-103 (2017).
- Guerzoni, L. P., Nicolas, V., Angelova, A. In vitro modulation of TrkB receptor signaling upon sequential delivery of curcumin-DHA loaded carriers towards promoting neuronal survival. Pharmaceutical Research. 34 (2), 492-505 (2017).
- Angelova, A., Angelov, B. Dual and multi-drug delivery nanoparticles towards neuronal survival and synaptic repair. Neural Regeneration Research. 12 (6), 886-889 (2017).
