Изображение и анализ нейрофиламента транспорта в акцизных мышь Tibial нерва
Summary
Мы описываем методы флуоресценции фотоактивации для анализа аксонального переноса нейрофилаций в одиночных миелинированных аксонах периферических нервов от трансгенных мышей, которые выражают фотоактивируемый белок нейрофиламента.
Abstract
Нейрофиламентные белковые полимеры перемещаются по аксонам в медленном компоненте аксонального транспорта со средней скоростью 0,35-3,5 мм в день. До недавнего времени изучение этого движения на месте было возможно только с помощью радиоизотопного пульсового маркировки, что позволяет анализировать аксональный транспорт в целых нервах с временным разрешением дней и пространственным разрешением миллиметров. Для изучения нейрофиламента транспорта на месте с более высоким висовым и пространственным разрешением, мы разработали hThy1-paGFP-NFM трансгенной мыши, которая выражает нейрофиламент белка M помечены фотоактивируемым GFP в нейронах. Здесь мы описываем флуоресценции фотоактивности пульс-побег и импульс-распространения методов для анализа нейрофиламента транспорта в одной миелинированной аксонов тибиальных нервов от этих мышей ex vivo. Изолированные сегменты нерва поддерживаются на стадии микроскопа перфузией с кислородом солевым раствором и изображения спиннинг диска конлокальной флуоресценции микроскопии. Фиолетовый свет используется для активации флуоресценции в коротком аксональном окне. Флуоресценция в активированных и фланговых областях анализируется с течением времени, что позволяет изучить транспортировку нейрофиламента с висовым и пространственным разрешением на порядок минут и микрон, соответственно. Математическое моделирование может быть использовано для извлечения кинетических параметров нейрофильтра транспорта, включая скорость, направленность и приостановощающее поведение из полученных данных. Методы пульса-побега и пульс-распространения также могут быть адаптированы для визуализации нейрофильтрамента транспорта в других нервах. С развитием дополнительных трансгенных мышей, эти методы могут также быть использованы для изображения и анализа аксональная транспорт других цитоскелетных и цитозолических белков в аксонах.
Introduction
Аксональный транспорт нейрофиламентов был впервые продемонстрирован в 1970-х годах радиоизотопной пульсовой маркировкой1. Этот подход дал огромное количество информации о нейрофильтра транспорта in vivo, но он имеет относительно низкий пространственный и временное разрешение, как правило, на порядок миллиметров и дней в лучшем случае2. Кроме того, радиоизотопная маркировка пульса является косвенным подходом, который требует инъекций и жертвоприношения нескольких животных для создания единого временного курса. С открытием флуоресцентных белков и достижений в флуоресценции микроскопии в 1990-х годов, впоследствии стало возможным изображение нейрофильтра транспорта непосредственно в культивируемых нейронов на шкале времени секунд или минут и с суб-микрометрового пространственного разрешения, предоставляя гораздо больше понимания механизма движения3. Эти исследования показали, что нейрофиламентные полимеры в аксонах быстро и периодически перемещаются как в антероградных, так и в ретроградных направлениях вдоль микротрубочек, движимых микротрубочками моторных белков. Тем не менее, нейрофиламенты дифракционно-ограниченные структуры всего 10 нм в диаметре, которые, как правило, расположены отдельно от своих соседей только на десятки нанометров; Таким образом, полимеры могут быть отслежены только в культивируемых нейронов, которые содержат редко распределенных нейрофиламентов, так что движущиеся полимеры могут быть решены от своих соседей4. Таким образом, в настоящее время невозможно отследить одиночные нейрофиламенты в аксонах, которые содержат обильные полимеры нейрофиламента, такие как миелинизированные аксоны.
Для анализа аксональной транспортировки нейрофилаций в нейрофиламент богатых аксонов с использованием флуоресценции микроскопии, мы используем флуоресценции фотоактивности импульс-побег метод, который мы разработали для изучения долгосрочного паузы поведение нейрофилаций в культивируемых нервных клеток4,5. Нейрофиламенты, помеченные фотоактивируемым флуоресцентным нейрофильтрным синтезом белка, активируются в коротком сегменте аксона, а затем скорость отхода этих нитей из активированной области количественно измеряется путем измерения флуоресценции распада с течением времени. Преимуществом такого подхода является то, что это анализ нейрофильтрации на уровне населения, который может применяться в времени минут или часов без необходимости отслеживать движение отдельных полимеров нейрофиламента. Например, мы использовали этот метод для анализа кинетики нейрофильтрации транспорта в миелинирующих культур6.
Недавно мы описали развитие hThy1-paGFP-NFM трансгенной мыши, которая выражает низкий уровень paGFP-тегами нейрофильтр белка M (paGFP-NFM) в нейронах под контролем человека нейрон-специфический Thy1 промоутер7. Эта мышь позволяет анализировать нейрофильтр транспортировки на месте с помощью флуоресценции микроскопии. В этой статье мы описываем экспериментальные подходы для анализа нейрофильтра транспорта в миелинированных аксонов тибиальных нервов от этих мышей с использованием двух подходов. Первый из этих подходов является описанным выше методом пульс-побега. Этот метод может генерировать информацию о приостановке поведения нейрофиламентов, но слеп к направлению, в котором нити отходят от активированной области, и, следовательно, не позволяет измерить чистую направленность и скорость транспортировки8. Второй из этих подходов представляет собой новый метод пульса распространения, в котором мы анализируем не только потерю флуоресценции из активированного региона, но и переходное увеличение флуоресценции в двух фланговых окнах, через которые перемещаются флуоресцентные нити при отходе от активированной области как в ангерозном, так и в ретроградном направлениях. В обоих подходах такие параметры нейрофильтра, как средняя скорость, чистая направленность и приостановление поведения, могут быть получены с помощью математического анализа и моделирования изменений флуоресценции в измерительных окнах. Рисунок 3 иллюстрирует эти два подхода.
Этот протокол демонстрирует вскрытие и подготовку нерва, активацию и визуализацию флуоресценции paGFP, а также количественную оценку транспортировки нейрофиламента из приобретенных изображений с использованием пакета распределения FIJI ImageJ9. Мы используем тибиальный нерв, потому что он длинный (несколько см) и не ветвиется; однако, в принципе любой нерв, выражаюющий paGFP-NFM подходит для использования с этой техникой, если он может быть рассечен и де-шейт без повреждения аксонов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Необходимо проявлять осторожность при анализе экспериментов по пульсу и пульс-распространению, поскольку существует значительный потенциал для введения ошибки во время постобработки, главным образом во время коррекции плоского поля, выравнивания изображения и коррекции отбеливате?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Паулу Монсма за обучение и помощь в проведении конфокальной микроскопии и рассечения tibial нерва, а также доктора Ацуко Учиды, Хлои Дюгер и Сану Чаханде за помощь в работе с мышью. Эта работа была частично поддержана совместным Национальным научным фондом грантов IOS1656784 А.Б. и IOS1656765 p.J., и Национальные институты здравоохранения Гранты R01 NS038526, P30 NS104177 и S10 OD010383 до A.B. N.P.B. была поддержана стипендией от Университета штата Огайо президента постдокторской программы ученых.
Materials
| 14 x 22 Rectangle Gasket 0.1mm | Bioptechs | 1907-1422-100 | inner gasket |
| 2-deoxy-D-glucose | Sigma | D6134 | |
| 30mm Round Gasket w/ Holes | Bioptechs | 1907-08-750 | outer gasket |
| 35 x 10mm dish | Thermo Fisher | 153066 | dissection dishes |
| 40mm round coverslips | Bioptechs | 40-1313-0319 | |
| 60mL syringe – Luer-lock tip | BD | 309653 | |
| Andor Revolution WD spinning-disk confocal system | Andor | outfitted with Perfect Focus and FRAPPA systems | |
| Calcium chloride | Fisher | C79 | |
| Coverslips | Fisher | 12-541-B | for fluorescein slide |
| D-(+)-glucose solution | Sigma | G8769 | |
| Dissecting pins | Fine Science Tools | 26001-70 | |
| Dissection forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | fine tipped forceps |
| Dissection microscope | Zeiss | 47 50 03 | |
| Dissection pan with wax | Ginsberg Scientific | 568859 | |
| Dissection scissors | Fine Science Tools | 14061-09 | initial dissection scissors |
| FCS2 perfusion chamber | Bioptechs | 060319-2-03 | |
| Fluorescein sodium | Fluka | 46960 | |
| Inline solution heater | Warner Instruments | SH27-B | |
| Laminectomy forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | initial dissection forceps |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Microaqueduct slide | Bioptechs | 130119-5 | |
| Microscope slides | Fisher | 12-544-3 | for fluorescein slide |
| Microscope stage insert | Applied Scientific Instrumentation | I-3017 | |
| Objective heater system | Okolab | Oko Touch with objective collar | |
| Objective oil – type A | Nikon | discontinued | |
| Plan Apo VC 100x 1.40 NA objective | Nikon | MRD01901 | |
| Potassium chloride | Fisher | P217 | |
| Potassium phosphate | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium iodoacetate | Sigma-Aldrich | I2512 | |
| Syringe pump | Sage Instruments | Model 355 | |
| Tubing adapter – female | Small Parts Inc. | 1005109 | |
| Tubing adapter – male | Small Parts Inc. | 1005012 | |
| Tygon tubing | Bioptechs | 1/16" ID, 1/32" wall thickness | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | fine scissors |
Referências
- Hoffman, P. N., Lasek, R. J. The slow component of axonal transport. Identification of major structural polypeptides of the axon and their generality among mammalian neurons. Journal of Cell Biology. 66 (2), 351-366 (1975).
- Brown, A. Slow Axonal Transport. Reference Module in Biomedical Sciences. , (2014).
- Wang, L., Ho, C. -. L., Sun, D., Liem, R. K. H., Brown, A. Rapid movement of axonal neurofilaments interrupted by prolonged pauses. Nature Cell Biology. 2 (3), 137-141 (2000).
- Uchida, A., Monsma, P. C., Fenn, J. D., Brown, A. Live-cell imaging of neurofilament transport in cultured neurons. Methods in Cell Biology. 131, 21-90 (2016).
- Trivedi, N., Jung, P., Brown, A. Neurofilaments switch between distinct mobile and stationary states during their transport along axons. Journal of Neuroscience. 27 (3), 507-516 (2007).
- Monsma, P. C., Li, Y., Fenn, J. D., Jung, P., Brown, A. Local regulation of neurofilament transport by myelinating cells. Journal of Neuroscience. 34 (8), 2979-2988 (2014).
- Walker, C. L., et al. Local Acceleration of Neurofilament Transport at Nodes of Ranvier. Journal of Neuroscience. 39 (4), 663-677 (2019).
- Li, Y., Brown, A., Jung, P. Deciphering the axonal transport kinetics of neurofilaments using the fluorescence photoactivation pulse-escape method. Physical Biology. 11 (2), 026001 (2014).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Breuer, A. C., et al. Fast axonal transport in amyotrophic lateral sclerosis: an intra-axonal organelle traffic analysis. Neurology. 37 (5), 738-748 (1987).
- Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, photoactivation, photoconversion, and FLIP. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (12), (2010).
- Model, M. Intensity calibration and flat-field correction for fluorescence microscopes. Current Protocols in Cytometry. 68, (2014).
- Schmidt, M. M., Dringen, R. Differential effects of iodoacetamide and iodoacetate on glycolysis and glutathione metabolism of cultured astrocytes. Frontiers in Neuroenergetics. 1, 1-10 (2009).
- Surre, J., et al. Strong increase in the autofluorescence of cells signals struggle for survival. Scientific Reports. 8 (1), 12088 (2018).
- Cox, M., Lucey, S., Sridharan, S., Cohn, J. Least Squares Congealing for Unsupervised Alignment of Images. Proceedings of the IEEE Computer Society Conference on Computer Vision and Pattern Recognition. , (2008).
- Huang, S., Heikal, A. A., Webb, W. W. Two-photon fluorescence spectroscopy and microscopy of NAD(P)H and flavoprotein. Biophysical Journal. 82 (5), 2811-2825 (2002).
- Fenn, J. D., Johnson, C. M., Peng, J., Jung, P., Brown, A. Kymograph analysis with high temporal resolution reveals new features of neurofilament transport kinetics. Cytoskeleton. 75 (1), 22-41 (2018).
- Alami, N. H., Jung, P., Brown, A. Myosin Va increases the efficiency of neurofilament transport by decreasing the duration of long-term pauses. Journal of Neuroscience. 29 (20), 6625-6634 (2009).
- Xu, Z., Tung, V. W. Temporal and Spatial Variations in Slow Axonal Transport Velocity Along Peripheral Motoneuron Axons. Neurociência. 102 (1), 193-200 (2001).
- Jung, P., Brown, A. Modeling the Slowing of Neurofilament Transport Along the Mouse Sciatic Nerve. Physical Biology. 6 (4), 046002 (2009).
- Cohen, J. The effect size index: d. Statistical Power Analysis for the Behavioral Sciences 2nd ed. , 20-26 (1988).
- Misgeld, T., Kerschensteiner, M., Bareyre, F. M., Burgess, R. W., Lichtman, J. W. Imaging axonal transport of mitochondria in vivo. Nature Methods. 4 (7), 559-561 (2007).
- Gilley, J., et al. Age-dependent axonal transport and locomotor changes and tau hypophosphorylation in a “P301L” tau knockin mouse. Neurobiology of Aging. 33 (3), 1-15 (2012).
- Marinkovic, P., et al. Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 109 (11), 4296-4301 (2012).
- Milde, S., Adalbert, R., Elaman, M. H., Coleman, M. P. Axonal transport declines with age in two distinct phases separated by a period of relative stability. Neurobiology of Aging. 36 (2), 971-981 (2015).
- Gibbs, K. L., Kalmar, B., Sleigh, J. N., Greensmith, L., Schiavo, G. In vivo imaging of axonal transport in murine motor and sensory neurons. Journal of Neuroscience Methods. 257, 26-33 (2016).
