Высокой пропускной способностью изображения руководствуясь стереотаксической нейронавигации и целенаправленной ультразвуковой системы для гемовеленно-мозгового барьера Открытие у грызунов

Summary

Геммоэнцербированный барьер (BBB) может быть временно нарушен с помощью микропузырька-опосредованного сфокусированного ультразвука (FUS). Здесь мы описываем пошаговые протоколы для высокой пропускной способности BBB открытия in vivo с использованием модульной системы FUS, доступной для экспертов, не являясь ультразвуком.

Abstract

Геммоемммм Эндотелиальные клетки, соединенные плотными соединениями, образуют физиологический барьер, препятствующий > молекул (>500 Da) в ткани мозга. Микропузырька опосредованное сфокусированное ультразвук (FUS) можно использовать для того чтобы навести преходящее местное отверстие BBB, позволяющ более большие снадобья войти parenchyma мозга.

В дополнение к крупномасштабным клиническим устройствам для клинического перевода, доклинические исследования для оценки реакции терапии кандидатов на препарат требует специальных малых животных ультразвуковых установок для целевого открытия BBB. Предпочтительно, чтобы эти системы позволяли использовать высокооборотные рабочие процессы как с высокой пространственной точностью, так и с комплексным мониторингом кавитации, при этом оставаясь экономически эффективными как с точки зрения первоначальных инвестиций, так и с точки зрения эксплуатационных расходов.

Здесь мы представляем биолюминесценцию и рентгеновская стереотаксическая система FUS для малых животных, которая основана на коммерчески доступных компонентах и соответствует вышеупомянутым требованиям. Особое внимание было уделено высокой степени автоматизации, облегчая проблемы, обычно встречающиеся в многотомных доклинических исследованиях по оценке лекарственных средств. Примерами этих проблем являются необходимость стандартизации для обеспечения воспроизводимости данных, уменьшения внутригрупповой изменчивости, уменьшения размера выборки и, таким образом, соблюдения этических требований и уменьшения ненужной рабочей нагрузки. Предлагаемая система BBB была проверена в рамках BBB открытия облегченные испытания доставки лекарств на пациента полученных ксенотрансплантатов модели глиобластомы мультиформной и диффузной средней линии глиомы.

Introduction

Гемовоэнцефалический барьер (BBB) является основным препятствием для доставки препарата в паренхиму мозга. Большинство терапевтических препаратов, которые были разработаны не пересекают BBB из-за их физико-химических параметров (например, липофилифия, молекулярный вес, водородные облигации принимает и доноров) или не сохраняются из-за их сродства к efflux транспортеров в^{головном мозге 1,2}. Небольшая группа препаратов, которые могут пересечь BBB, как правило, небольшие липофильные молекулы, которые эффективны только в ограниченном количестве^{заболеваний мозга 1,2}. Как следствие, для большинства заболеваний головного мозга, фармакологические варианты лечения ограничены и новые стратегии доставки^{лекарств необходимы 3,4}.

Терапевтическое УЗИ является новой техникой, которая может быть использована для различных неврологических приложений, таких как нарушение BBB (BBBD), нейромодуляция, и^{абляция4,5,6,7}. Для достижения открытия BBB с экстракорпоратерным ультразвуковым излучателем через череп, сфокусированное УЗИ (FUS) сочетается с микропузырями. Микросовместимые FUS приводит к повышенной биодоступности препаратов в паренхиме^{мозга 5,8,9.} При наличии звуковых волн микропузырьки начинают колебаться, инициируя трансцитоз и нарушение плотных соединений между эндотелиальными клетками BBB, что позволяет параклеточной транспортировке больших молекул¹⁰. Предыдущие исследования подтвердили корреляцию между интенсивностью акустического излучения и биологическим воздействием на открытие BBB^11,12,13,14. FUS в сочетании с микропузырями уже используется в клинических испытаниях для лечения глиобластомы с использованием темозоломида или липосомного доксорубицина в качестве химиотерапевтического агента, или для терапии болезни Альцгеймера и бокового^{амиотрофического склероза 5,9,15,16}.

Поскольку ультразвук опосредованное открытие BBB открывает совершенно новые возможности для фармакотерапии, для оценки реакции отдельных кандидатов на лекарственные препараты необходимы доклинические исследования клинического перевода. Это обычно требует высокой пропускной способности рабочего процесса с высокой пространственной точностью и предпочтительно комплексного обнаружения кавитации для мониторинга целевого открытия BBB с высокой воспроизводимостью. Если это возможно, эти системы должны быть экономически эффективными как в первоначальных инвестиций и эксплуатационных расходов, с тем чтобы быть масштабируемым в зависимости от размера исследования. Большинство доклинических систем FUS сочетаются с МРТ для изображения руководства и^{планирования лечения 15,17,18,19}. Хотя МРТ дает подробную информацию об анатомии опухоли и объеме, это дорогой метод, который обычно выполняется обученными / квалифицированными операторами. Кроме того, МРТ высокого разрешения не всегда может быть доступна для исследователей в доклинических учреждениях и требует длительного времени сканирования на животное, что делает его менее пригодным для высокопроверяющих фармакологических исследований. Примечательно, что для доклинических исследований в области нейроонкологии, в частности, инфильтративных опухолевых моделей, возможность визуализировать и нацелить опухоль имеет важное значение для^{успеха лечения 20}. В настоящее время это требование выполняется только МРТ или опухолями, трансфокированными с помощью фотопротеина, что позволяет визуализировать биолюминесценцию изображения (BLI) в сочетании с администрированием подстрата фотопротеина.

СИСТЕМы МРТ-управляемые FUS часто используют водяную баню для обеспечения распространения ультразвуковой волны для транскраниальных применений, при которой голова животного частично погружается в воду, так называемые системы^{«снизу вверх» 15,17,18.} Хотя эти проекты работают в целом хорошо в небольших исследований на животных, они являются компромиссом между временем подготовки животных, портативность и реально поддерживать гигиенические стандарты во время использования. В качестве альтернативы МРТ, другие методы руководства для стереотаксической навигации включают в себя использование^{грызунов анатомического атласа 21,22,23}, лазерная указка помощь^{визуального прицельной 24}, пинхол-помощь механического сканирующего устройства²⁵, или BLI²⁶. Большинство из этих конструкций являются “сверху вниз” системы, в которых предуц находится на верхней части головы животного, с животным в естественном положении. Рабочий процесс ‘top-down’ состоит либо из водяной^{ванны 22,25,26 или}заполненного водой^{конуса 21,24.} Преимущество использования преобразоваваека внутри закрытого конуса является более компактный след, короче время установки и прямо вперед возможности обеззараживания упрощает весь рабочий процесс.

Взаимодействие акустического поля с микропузырями зависит от давления и колеблется от низкоамплитудных колебаний (называемых стабильной кавитацией) до переходного коллапса пузыря (именуемого инерциальной кавитацией)^27,28. Существует установленный консенсус, что ультразвук-BBBD требует акустического давления значительно выше стабильного порога кавитации для достижения успешного BBBD, но ниже порога инерциальной кавитации, который обычно ассоциируется с сосудистыми / нейрональными^{повреждениями 29}. Наиболее распространенной формой мониторинга и контроля является анализ (обратного) рассеянного акустического сигнала с использованием пассивного обнаружения кавитации (PCD), как это предлагается McDannold et al.¹². PCD опирается на анализ спектров Fourier микропузырьковых сигналов выбросов, в котором сила и внешний вид стабильных признаков кавитации (гармоники, субгармоника и ультрагармоника) и инерционные маркеры кавитации (широкополосная реакция) могут быть измерены в режиме реального времени.

“Один размер подходит всем” PCD-анализ для точного контроля давления осложняется из-за полидисперсности формулировки microbubble (амплитуля колебаний сильно зависит от диаметра пузыря), различия в свойствах оболочки пузыря между брендами, и акустические колебания, которые сильно зависят от^{частоты и давления 30,31,32}. Как следствие, было предложено много различных протоколов обнаружения PCD, которые были адаптированы к конкретным комбинациям всех этих параметров и были использованы в различных сценариях применения (от экспериментов in vitro над протоколами малых животных до PCD для клинического использования) для надежного обнаружения кавитации и даже для обратной^{связи давления 11,14,30,31,32,33,34,35}. Протокол PCD, используемый в рамках данного исследования, получен непосредственно из McDannold et al.^{12 и} отслеживает гармоническое излучение на наличие стабильной кавитации и широкополосного шума для обнаружения инерциальной кавитации.

Мы разработали систему нейронавигации FUS с изображением для временного открытия BBB для увеличения доставки препарата в паренхиму мозга. Система основана на коммерчески доступных компонентах и может быть легко адаптирована к нескольким различным методам визуализации, в зависимости от имеющихся методов визуализации в животном объекте. Поскольку нам требуется рабочий процесс с высокой пропускной способностью, мы решили использовать рентгеновские снимки и BLI для планирования изображений и лечения. Опухолевые клетки, трансдуцированные с помощью фотопротеина (например, люцифераза), подходят для^{bli-изображения 20.} После введения подстрата фотопротеина, опухолевые клетки могут контролироваться in vivo и рост опухоли и расположение^{может быть определено 20,36}. BLI является недорогим методом визуализации, он позволяет следить за ростом опухоли с течением времени, он имеет быстрое время сканирования и хорошо коррелирует с ростом опухоли измеряется МРТ^36,37. Мы решили заменить водяную баню заполненным водой конусом, прикрепленным к преобразоваю, чтобы гибкость позволила свободно перемещать платформу, на которой^{смонтирован грызун 8,24}. Конструкция основана на съемной платформе, оснащенной интеграцией (I) маловодной стереотаксической платформы (II) фидуциальных маркеров с рентгеновской и оптическо-образной совместимостью (III) быстросемещанной анестезии и (IV) интегрированной системой нагрева животных. После первоначальной индукции анестезии животное устанавливается в точном положении на платформе, где оно остается в течение всей процедуры. Следовательно, вся платформа проходит все станции рабочего процесса всего вмешательства, сохраняя при этом точное и воспроизводимое позиционирование и устойчивую анестезию. Программное обеспечение управления позволяет автоматически обнаруживать фидуциальные маркеры и автоматически регистрирует все типы изображений и модальностей изображения (т.е. микро-КТ, рентгеновские, BLI и флуоресценции изображения) в рамках справочной стереотаксической платформы. С помощью автоматической процедуры калибровки, фокусное расстояние ультразвукового превью точно известно внутри, что позволяет автоматическим слиянием интервенционного планирования, акустической доставки и последующего анализа изображений. Как показано на рисунке 1 и рисунке 2,эта установка обеспечивает высокую степень гибкости для разработки специальных экспериментальных рабочих процессов и позволяет переплетенной обработки животных на различных станциях, что в свою очередь облегчает высокую пропускную способность экспериментов. Мы использовали этот метод для успешной доставки лекарств в ксенотрансплантатах мыши высококачественной глиомы, таких как диффузная глиома средней линии.

Protocol

Все эксперименты in vivo были одобрены голландским комитетом по этике (номер разрешения на лицензию AVD114002017841) и Органом защиты животных Vrije Universiteit Amsterdam, Нидерланды. Исследователи прошли подготовку по основам системы FUS, чтобы свести к минимуму дискомфорт животных. 1. Сфокусир?…

Representative Results

Описанная система FUS (рисунок1 и рисунок 2) и связанный с ней рабочий процесс были использованы в более чем 100 животных и производится воспроизводимые данные о здоровых и опухолевых мышей. Основываясь на записанной кавитации и спектральной плотности гарм?…

Discussion

В этом исследовании мы разработали экономически эффективную систему FUS на основе изображения для временного нарушения BBB для увеличения доставки препарата в паренхиму мозга. Система была построена в основном с коммерчески доступными компонентами и в сочетании с рентгеновскими и BLI. Мо…

Materials

1 mL luer-lock syringe	Becton Dickinson	309628	Plastipak
19 G needle	Terumo Agani	8AN1938R1
23 G needle	Terumo Agani	8AN2316R1
3M Transpore surgical tape	Science applied to life	7000032707	or similar
Arbitrary waveform generator	Siglent	n.a.	SDG1025, 25 MHz, 125 Msa/s
Automated stereotact	in-house built	n.a.	Stereotact with all elements were in-house built
Bruker In-Vivo Xtreme	Bruker	n.a.	Includes software
Buffered NaCl solution	B. Braun Melsungen AG	220/12257974/110
Buprenorfine hydrochloride	Indivior UK limitd	n.a.	0.324 mg
Cage enrichment: paper-pulp smart home	Bio services	n.a.
Carbon filter	Bickford	NC0111395	Omnicon f/air
Ceramic spoon	n.a	n.a.
Cotton swabs	n.a.	n.a.
D-luciferin, potassium salt	Gold Biotechnology	LUCK-1
Ethanol	VUmc pharmacy	n.a.	70%
Evans Blue	Sigma Aldrich	E2129
Fresenius NaCl 0.9%	Fresenius Kabi	n.a.	NaCl 0.9 %, 1000 mL
Histoacryl	Braun Surgical	n.a.	Histoacryl 0.5 mL
Hydrophone	Precision Acoustics	n.a.
Insulin syringe	Becton Dickinson	324825/324826	0.5 mL and 0.3 mL
Isoflurane	TEVA Pharmachemie BV	8711218013196	250 mL
Ketamine	Alfasan	n.a.	10 %, 10 mL
Mouse food: Teklad global 18% protein rodent diet	Envigo	2918-11416M
Neoflon catheter	Becton Dickinson	391349	26 GA 0.6 x 19 mm
Oscilloscope	Keysight technologies	n.a.	InfiniiVision DSOX024A
Plastic tubes	Greiner bio-one	210261	50 mL
Power amplifier	Electronics & Innovation Ltd	210L	Model 210L
Preamplifier DC Coupler	Precision Acoustics	n..	Serial number: DCPS94
Scissors	Sigma Aldrich	S3146-1EA	or similar
Sedazine	AST Farma	n.a.	2%
SonoVue microbubbles	Bracco	n.a.	8 µl/ml
Sterile water	Fresenius Kabi	n.a.	1000 mL
Syringe	n.a.	n.a.	various syringes can be used
Temgesic	Indivior UK limitd	n.a.	0.3 mg/ml
Transducer	Precision Acoustics	n.a.	1 MHz
Tweezers	Sigma Aldrich	F4142-1EA	or similar
Ultrasound gel	Parker Laboratories Inc.	01-02	Aquasonic 100
Vidisic gel	Bausch + Lomb	n.a.	10 g