Ett bildstyrt stereotaktiskt neuronavigation med hög genomströmning och fokuserat ultraljudssystem för öppning av blod- hjärnbarriärer hos gnagare

Summary

Blod- hjärnbarriären (BBB) kan tillfälligt störas med mikrobubble-medierat fokuserat ultraljud (FUS). Här beskriver vi ett steg-för-steg-protokoll för hög genomströmning BBB-öppning in vivo med hjälp av ett modulärt FUS-system tillgängligt för icke-ultraljudsexperter.

Abstract

Blod- hjärnbarriären (BBB) har varit ett stort hinder för behandling av olika hjärnsjukdomar. Endotelceller, förbundna med snäva korsningar, bildar en fysiologisk barriär som förhindrar att stora molekyler (>500 Da) kommer in i hjärnvävnaden. Microbubble-medierad fokuserad ultraljud (FUS) kan användas för att inducera en övergående lokal BBB öppning, så att större läkemedel kan komma in i hjärnan parenkym.

Förutom storskaliga kliniska enheter för klinisk översättning kräver preklinisk forskning för behandlingsresponsbedömning av läkemedelskandidater dedikerade smådjur ultraljudsinställningar för riktad BBB-öppning. Helst tillåter dessa system arbetsflöden med hög genomströmning med både hög rumslig precision och integrerad kavitationsövervakning, samtidigt som de är kostnadseffektiva i både initiala investeringar och driftskostnader.

Här presenterar vi ett bioluminescens- och röntgenstyrt stereotaktiskt FUS-system för smådjur som bygger på kommersiellt tillgängliga komponenter och uppfyller ovan nämnda krav. Särskild vikt har lagts vid en hög grad av automatisering som underlättar de utmaningar som vanligtvis uppstår i prekliniska läkemedelsutvärderingsstudier med hög volym. Exempel på dessa utmaningar är behovet av standardisering för att säkerställa data reproducerbarhet, minska variabiliteten inom gruppen, minska urvalsstorleken och därmed uppfylla etiska krav och minska onödig arbetsbelastning. Det föreslagna BBB-systemet har validerats inom ramen för BBB-öppnandet av underlättade läkemedelsleveransförsök på patientbaserade xenograftmodeller av glioblastom multiforme och diffusa midline glioma.

Introduction

Blod- hjärnbarriären (BBB) är ett stort hinder för läkemedelsleverans till hjärnans parenkym. De flesta terapeutiska läkemedel som har utvecklats korsar inte BBB på grund av deras fysikaliskkemiska parametrar (t.ex. lipofilibilitet, molekylvikt, vätebindnings acceptorer och givare) eller behålls inte på grund av deras affinitet för utflödestransportörer i hjärnan^1,2. Den lilla gruppen läkemedel som kan korsa BBB är vanligtvis små lipofila molekyler, som bara är effektiva i ett begränsat antal hjärnsjukdomar^1,2. Som en följd av detta, för de flesta hjärnsjukdomar, är farmakologiska behandlingsalternativ begränsade och nya drug delivery-strategier behövs^3,4.

Terapeutisk ultraljud är en framväxande teknik som kan användas för olika neurologiska applikationer såsom BBB-störningar (BBBD), neuromodulering och ablation^4,5,6,7. För att uppnå en BBB-öppning med en extrakorpooreal ultraljudsemitterare genom kraniet kombineras fokuserat ultraljud (FUS) med mikrobubblor. Mikrobubble-medierad FUS resulterar i ökad biotillgänglighet av läkemedel i hjärnan parenkym^5,8,9. I närvaro av ljudvågor börjar mikrobubblor svänga initiering av transcytos och störningar av de snäva korsningarna mellan endotelcellerna i BBB, vilket möjliggör paracellulär transport av större molekyler¹⁰. Tidigare studier bekräftade sambandet mellan intensiteten i det akustiska utsläppet och den biologiska påverkan på BBB-öppningen^11,12,13,14. FUS i kombination med mikrobubblor har redan använts i kliniska prövningar för behandling av glioblastom med temozolomid eller liposomal doxorubicin som kemoterapeutiskt medel, eller för behandling av Alzheimers sjukdom och amyotrofisk lateral skleros^5,9,15,16.

Eftersom ultraljud medierad BBB-öppning resulterar i helt nya möjligheter till farmakoterapi, behövs preklinisk forskning för klinisk översättning för att bedöma terapisvaret hos utvalda läkemedelskandidater. Detta kräver vanligtvis ett arbetsflöde med hög genomströmning med både hög rumslig precision och helst en integrerad kavitationsdetektering för övervakning av riktad BBB-öppning med hög reproducerbarhet. Om möjligt måste dessa system vara kostnadseffektiva i både initiala investeringar och driftskostnader för att kunna skalbara enligt studiestorleken. De flesta prekliniska FUS-system kombineras med MRT för bildvägledning och behandlingsplanering^15,17,18,19. Även om MRI ger detaljerad information om tumör anatomi och volym, är det en dyr teknik, som i allmänhet utförs av utbildade / skickliga operatörer. Dessutom kanske högupplöst MRT inte alltid är tillgängligt för forskare i prekliniska anläggningar och kräver långa skanningstider per djur, vilket gör det mindre lämpligt för farmakologiska studier med hög genomströmning. Anmärkningsvärt är att för preklinisk forskning inom neuro-onkologi, i synnerhet infiltrativa tumörmodeller, är möjligheten att visualisera och rikta tumören avgörande för behandlingsframgång²⁰. För närvarande uppfylls detta krav endast av MRI eller av tumörer transduced med ett fotoprotein, vilket möjliggör visualisering med bioluminescens imaging (BLI) i kombination med administrering av fotoprotein substrat.

MRI-styrda FUS-system använder ofta ett vattenbad för att säkerställa ultraljudsvågspridning för transkraniella tillämpningar, varigenom djurets huvud delvis är nedsänkt i vattnet, de så kallade “bottom-up”-systemen^15,17,18. Även om dessa konstruktioner i allmänhet fungerar bra i mindre djurstudier, är de en kompromiss mellan djurberedningstider, bärbarhet och realistiskt underhållbara hygieniska standarder under användning. Som ett alternativ till MRI omfattar andra styrmetoder för stereotaktisk navigering användningen av en gnagare anatomisk atlas^21,22,23, laserpekare assisterad visuell observation²⁴, pinhole-assisted mekanisk skanning enhet²⁵, eller BLI²⁶. De flesta av dessa mönster är “top-down” -system där givaren placeras ovanpå djurets huvud, med djuret i en naturlig position. Arbetsflödet “uppifrån och ned” består antingen av ett vattenbad^22,25,26 eller en vattenfylld kon^21,24. Fördelen med att använda en givare inuti en sluten kon är det mer kompakta fotavtrycket, kortare installationstid och möjligheter till direkt sanering som förenklar hela arbetsflödet.

Interaktionen mellan det akustiska fältet och mikrobubblorna är tryckberoende och sträcker sig från oscillationer med låg amplitud (kallas stabil kavitation) till övergående bubbelkollaps (kallad inertial kavitation)^27,28. Det finns en etablerad konsensus om att ultraljud-BBBD kräver ett akustiskt tryck långt över den stabila kavitation tröskeln för att uppnå framgångsrika BBBD, men under den inertiella kavitation tröskeln, som i allmänhet är associerad med vaskulär/neuronal skada²⁹. Den vanligaste formen av övervakning och kontroll är analysen av den (rygg)spridda akustiska signalen med passiv kavitationsdetektering (PCD), som föreslagits av McDannold et al.¹². PCD bygger på analys av Fourier-spektrat av mikrobubblors emissionssignaler, där styrkan och utseendet hos stabila kavitationsmärken (övertoner, subharmoniker och ultraharmoniker) och inerta kavitationsmarkörer (bredbandsrespons) kan mätas i realtid.

En “en storlek passar alla” PCD-analys för exakt tryckkontroll är komplicerad på grund av mikrobubbleformuleringens polydispersitet (oscillationsamlituden beror starkt på bubbeldiametern), skillnaderna i bubbelskalegenskaper mellan märken och den akustiska svängningen, som starkt beror på frekvens och tryck^30,31,32. Som en följd av detta har många olika PCD-detekteringsprotokoll föreslagits, som har anpassats till särskilda kombinationer av alla dessa parametrar och har använts i olika applikationsscenarier (allt från in vitro-experiment över små djurprotokoll till PCD för klinisk användning) för robust kavitationsdetektering och även för retroaktiv återkopplingskontroll av trycket^{11,14,30,31,32,33,34,35}. PcD-protokollet som används inom ramen för denna studie härleds direkt från McDannold et al.¹² och övervakar det harmoniska utsläppet för förekomst av stabil kavitation och bredbandsbuller för inertiell kavitationsdetektering.

Vi har utvecklat ett bildstyrt neuronavigation FUS-system för övergående öppning av BBB för att öka läkemedelstillförseln till hjärnan parenkym. Systemet bygger på kommersiellt tillgängliga komponenter och kan enkelt anpassas till flera olika bildframställningsmetoder, beroende på tillgängliga bildtekniker i djuranläggningen. Eftersom vi behöver ett arbetsflöde med hög genomströmning har vi valt att använda röntgen och BLI för bildvägledning och behandlingsplanering. Tumörceller transduced med ett fotoprotein (t.ex. luciferas) är lämpliga för BLI imaging²⁰. Efter administrering av fotoproteinsubstratet kan tumörceller övervakas in vivo och tumörtillväxt och plats kan^{bestämmas 20,36}. BLI är en billig bildframställning modalitet, det gör det möjligt att följa tumörtillväxten över tid, den har snabba skanningstider och det korrelerar väl med tumörtillväxt mätt med MRI^36,37. Vi har valt att ersätta vattenbadet med en vattenfylld kon fäst vid givaren för att möjliggöra flexibilitet att fritt flytta plattformen där gnagaren är monterad^8,24. Designen är baserad på en avtagbar plattform utrustad med integrering av (I) smådjurs stereotaktiska plattform (II) fiducialmarkörer med både röntgen- och optisk bildkompatibilitet (III) snabbavtagbar anestesimask och (IV) integrerat temperaturreglerat djurvärmesystem. Efter den första induktionen av anestesi monteras djuret i ett exakt läge på plattformen där det förblir under hela proceduren. Följaktligen passerar hela plattformen alla stationer i arbetsflödet för hela insatsen, samtidigt som en korrekt och reproducerbar positionering upprätthålls och en ihållande anestesi upprätthålls. Kontrollprogramvaran gör det möjligt att automatiskt detektera fiducialmarkörerna och registrerar automatiskt alla typer av bilder och bildmodaliteter (dvs. mikro-CT, röntgen, BLI och fluorescensavbildning) i referensramen för den stereotaktiska plattformen. Med hjälp av ett automatiskt kalibreringsförfarande är ultraljudsgivarens brännvidd exakt känd inom, vilket möjliggör automatisk fusion av interventionell planering, akustisk leverans och uppföljande bildanalys. Som visas i figur 1 och figur 2ger denna inställning en hög grad av flexibilitet för att utforma dedikerade experimentella arbetsflöden och möjliggör interfolierade hantering av djuret på olika stationer, vilket i sin tur underlättar experiment med hög genomströmning. Vi har använt denna teknik för framgångsrik läkemedelsleverans i mus xenografts av hög kvalitet gliom såsom diffusa mittlinjen gliom.

Protocol

Alla in vivo-experiment godkändes av den nederländska etiska kommittén (licenstillståndsnummer AVD114002017841) och djurskyddsorganet i Vrije Universiteit Amsterdam, Nederländerna. Utredarna utbildades i grunderna i FUS-systemet för att minimera djurens obehag. 1. Fokuserat ultraljudssystem OBS: Den beskrivna installationen är ett inhousebyggt BBB-störningssystem baserat på kommersiellt tillgängliga komponenter och innehåller en 3D-utskriven specialtillverk…

Representative Results

Det beskrivna FUS-systemet (figur 1 och figur 2) och det tillhörande arbetsflödet har använts i över 100 djur och producerat reproducerbara data om både friska möss och tumörbärande möss. Baserat på den registrerade kavitationen och spektraltätheten vid övertonerna under det högsta ögonblicket av mikrobubble bolus-injektionen kan spektraleffekten för varje frekvens beräknas med hjälp av Fourier-analysen enligt vad som förklaras i steg 4 i proto…

Discussion

I denna studie utvecklade vi ett kostnadseffektivt bildstyrt FUS-system för övergående BBB-störningar för ökad läkemedelstillförsel till hjärnans parenkym. Systemet byggdes till stor del med kommersiellt tillgängliga komponenter och i samband med röntgen och BLI. Den föreslagna designens modularitet gör det möjligt att använda flera bildframställningsmetoder för planering och utvärdering i arbetsflöden med hög genomströmning. Systemet kan kombineras med mer omfattande högupplösta 3D-bildframställn…

Materials

1 mL luer-lock syringe	Becton Dickinson	309628	Plastipak
19 G needle	Terumo Agani	8AN1938R1
23 G needle	Terumo Agani	8AN2316R1
3M Transpore surgical tape	Science applied to life	7000032707	or similar
Arbitrary waveform generator	Siglent	n.a.	SDG1025, 25 MHz, 125 Msa/s
Automated stereotact	in-house built	n.a.	Stereotact with all elements were in-house built
Bruker In-Vivo Xtreme	Bruker	n.a.	Includes software
Buffered NaCl solution	B. Braun Melsungen AG	220/12257974/110
Buprenorfine hydrochloride	Indivior UK limitd	n.a.	0.324 mg
Cage enrichment: paper-pulp smart home	Bio services	n.a.
Carbon filter	Bickford	NC0111395	Omnicon f/air
Ceramic spoon	n.a	n.a.
Cotton swabs	n.a.	n.a.
D-luciferin, potassium salt	Gold Biotechnology	LUCK-1
Ethanol	VUmc pharmacy	n.a.	70%
Evans Blue	Sigma Aldrich	E2129
Fresenius NaCl 0.9%	Fresenius Kabi	n.a.	NaCl 0.9 %, 1000 mL
Histoacryl	Braun Surgical	n.a.	Histoacryl 0.5 mL
Hydrophone	Precision Acoustics	n.a.
Insulin syringe	Becton Dickinson	324825/324826	0.5 mL and 0.3 mL
Isoflurane	TEVA Pharmachemie BV	8711218013196	250 mL
Ketamine	Alfasan	n.a.	10 %, 10 mL
Mouse food: Teklad global 18% protein rodent diet	Envigo	2918-11416M
Neoflon catheter	Becton Dickinson	391349	26 GA 0.6 x 19 mm
Oscilloscope	Keysight technologies	n.a.	InfiniiVision DSOX024A
Plastic tubes	Greiner bio-one	210261	50 mL
Power amplifier	Electronics & Innovation Ltd	210L	Model 210L
Preamplifier DC Coupler	Precision Acoustics	n..	Serial number: DCPS94
Scissors	Sigma Aldrich	S3146-1EA	or similar
Sedazine	AST Farma	n.a.	2%
SonoVue microbubbles	Bracco	n.a.	8 µl/ml
Sterile water	Fresenius Kabi	n.a.	1000 mL
Syringe	n.a.	n.a.	various syringes can be used
Temgesic	Indivior UK limitd	n.a.	0.3 mg/ml
Transducer	Precision Acoustics	n.a.	1 MHz
Tweezers	Sigma Aldrich	F4142-1EA	or similar
Ultrasound gel	Parker Laboratories Inc.	01-02	Aquasonic 100
Vidisic gel	Bausch + Lomb	n.a.	10 g