Avbildning och analys av oljeröda O-färgade hela aorta lesioner i en aneurysm hyperlipidemi musmodell
Summary
Detta protokoll ger ett steg-för-steg-förfarande för att analysera aterosklerotisk börda hos möss. Utredare kan använda detta protokoll för att jämföra överflöd, plats och storlek på aterosklerotiska lesioner hos olika djur.
Abstract
Apolipoprotein E (Apoe) – eller lågdensitetslipoproteinreceptor (Ldlr) -brist hyperlipidemiska möss är de två vanligaste modellerna för aterosklerosforskning. De används för att studera effekterna av olika genetiska faktorer och olika celltyper på aterosklerotisk lesionsbildning och samt testa utvecklingen av nya terapier. Isolering, excision av hela aortan och kvantifiering av oil red O-färgade aterosklerotiska lesioner är grundläggande morfometriska metoder som används för att utvärdera aterosklerotisk börda. Målet med detta protokoll är att beskriva en optimerad, steg-för-steg kirurgisk metod för att dissekera, perfuse-fix, isolera, fläcka, avbilda och analysera aterosklerotiska lesioner i musaortor med Oil Red O. Eftersom aterosklerotiska lesioner kan bildas var som helst i hela aortaträdet, har hela denna aorta Oil Red O-färgningsmetod fördelen att utvärdera lipidbelastade plack i hela aortan och alla grenar i en enda mus. Förutom Oil Red O-färgning kan färska isolerade hela aortor användas för olika in vitro- och in vivo-experiment och cellisoleringar.
Introduction
Kranskärlssjukdom, en ledande dödsorsak i USA, orsakas vanligtvis av åderförkalkning, en process som leder till uppbyggnad av plack inuti artärväggarna1. Hyperlipidemi-benägna Apoe- och Ldlr-bristfälliga möss är centrala för undersökningar av åderförkalkning och dess komplikationer och utveckling av terapier2,3,4,5. Kvantifiering av aterosklerotiska lesioner från en aorta med ansiktet är en viktig endpointanalys för att utvärdera effekterna av genetisk manipulation i olika celltyper. Det hjälper också till att studera nya terapier som är utformade för att påverka aterosklerotisk sjukdomsinitiering, progression och regression. Aterosklerotiska lesioner kan bildas var som helst i aortan och dess grenar (dvs. brachiocephalic, carotid och subclavian artärer i bröstet, liksom njur-, vanliga iliac- och lårbensartärer under membranet)6. En omfattande utvärdering av åderförkalkningsbördan och lämplig behandling kräver bedömning av sjukdomsbördan på olika platser, en utmaning som ofta förbises.
Detta protokoll beskriver hur man utför en omfattande analys av aterosklerotiska lesioner, som börjar med en oöppnad hel aorta och fortsätter till en ansiktsberedning, i en enda mus. Oöppnad hel aortaolja Röd O-färgning möjliggör snabb, kvalitativ bedömning av lipidbelastade plack i hela aortan och dess grenar, medan ansiktsberedning ger en kvantitativ bedömning av aterosklerotisk lesionsfördelning i musaortan.
Tekniken använder 8 veckor gamla möss med en glattmuskelcellspecifik TGFβR2-deletion på Apoe-/- hyperlipidemisk bakgrund (MYH11-CreERT2; Tgfbr2f/f;mT/mGf/f; Apoe-/-; nedan kallade TGFβR2iSMC-Apoe-möss) och kullkamrat Apoe-/- kontroller (MYH11-CreERT2;mT/mGf/f; Apoe-/-; nedan kallad Apoe-/- möss). Djuren hålls i 16 veckor på en HCHFD (High Cholesterol High Fat Diet) som studiematerial7. Vid studieavslutning färgas och avbildas de oöppnade hela aortorna (inklusive alla större grenar) med Oil Red O för kvalitativ bedömning av lipidbelastade plack. Aortorna skärs upp via en ansiktsberedning, och alla aterosklerotiska lesioner avbildas och kvantifieras. Detta protokoll kan användas för att studera aterosklerotisk lesionsutveckling i Apoe-/- eller Ldlr-/- hyperlipidemi mössmodeller och utvidgas till allmänna aortarelaterade vaskulära biologiska applikationer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Apolipoprotein E (Apoe) och lågdensitetslipoproteinreceptor (Ldlr) bristfälliga möss är användbara för att studera utveckling och behandling av ateroskleros. Utredare kan utvärdera effekterna av genetik och terapeutiska manipulationer på aterosklerosrelaterade sjukdomar initiering, progression och regression med hjälp av Oil Red O-färgning av hela aortan9. Aorta Oil Red O-färgning och lesionskvantifiering är guldstandardens slutpunkt för aterosklerosforskning. Denna …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes delvis av ett gemensamt biologiskt konsortium Microgrant som tillhandahölls under NIH-bidrag P30AR070253 (P.-Y.C.) och HL135582 (M.S.). Vi är tacksamma för R. Webber och L. Coon för att upprätthålla mössen som används i denna studie.
Materials
| 1.5 mL Eppendorf tube | DENVILLE | C2170 | |
| 10 mL syringe | BD | 302995 | |
| 16% Formaldehyde | Polysciences | 18814-10 | |
| 70% ethanol | VWR | RC2546.70-5 | To clean the dissection tools |
| Black dissection wax | CR Scientific | C3541 | |
| Corn oil | Sigma | C8267 | Solvent for Tamoxifen |
| DNeasy Blood & Tissue kit | QIAGEN | 69506 | To isolate DNA from mouse ear |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered saline (1X DPBS), pH 7.4 | Gibco | 14190-144 | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | To cut the mouse skin and open the ribcage |
| Fisherbrand Economy Plain Glass Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | |
| High cholesterol high fat diet | Research Diets | D12108 | To induce atherosclerosis |
| Imaging software | National Institutes of Health | Image J | Aortic lesion quantification |
| Isopropanol | VWR | JT9079-5 | |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | To clean the glass microscope slides |
| McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors | ROBOZ | RS-5602 | To separate the heart and the aorta and to cut open the aorta and aorta branches |
| Microscope control software | Olympus | DP Controller | For aorta imaging |
| Minutien pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Needle-25G | BD | 305124 | |
| NonWoven Sponge | McKesson | 94442000 | |
| Oil Red O | Sigma | O-0625 | To stain the atherosclerosis lesions |
| Pall Acrodisc Sterile Syringe Filters with Super Membrane | VWR | 28143-312 | To filter working Oil Red O solution |
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15021-15 | To dissect and clean the aorta |
| Statistical software | GraphPad | Prism 8 | Statical analysis |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | For aorta dissection |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | For aorta imaging |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | To induce Cre-loxP recombination |
| Tissue-Tek O.C.T Compound, Sakura Finetek | VWR | 25608-930 | |
| Tweezer Style 4 | Electron Microscopy Sciences | 0302-4-PO | To cut the mouse skin and open the ribcage |
| Tweezer Style 5 | Electron Microscopy Sciences | 0302-5-PO | To dissect and clean the aorta |
Referências
- Lusis, A. J. Atherosclerosis. Nature. 407, 233-241 (2000).
- Emini Veseli, B., et al. Animal models of atherosclerosis. European Journal of Pharmacology. 816, 3-13 (2017).
- Plump, A. S., et al. Severe hypercholesterolemia and atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice created by homologous recombination in ES cells. Cell. 71, 343-353 (1992).
- Zhang, S. H., Reddick, R. L., Piedrahita, J. A., Maeda, N. Spontaneous hypercholesterolemia and arterial lesions in mice lacking apolipoprotein E. Science. 258, 468-471 (1992).
- Ishibashi, S., et al. Hypercholesterolemia in low density lipoprotein receptor knockout mice and its reversal by adenovirus-mediated gene delivery. Journal of Clinical Investigation. 92, 883-893 (1993).
- Nakashima, Y., Plump, A. S., Raines, E. W., Breslow, J. L., Ross, R. ApoE-deficient mice develop lesions of all phases of atherosclerosis throughout the arterial tree. Arteriosclerosis Thrombosis. 14, 133-140 (1994).
- Chen, P. Y., et al. Smooth muscle cell reprogramming in aortic aneurysms. Cell Stem Cell. 26, 542-557 (2020).
- Andres-Manzano, M. J., Andres, V., Dorado, B. Oil Red O and Hematoxylin and Eosin Staining for Quantification of Atherosclerosis Burden in Mouse Aorta and Aortic Root. Methods in Molecular Biology. 1339, 85-99 (2015).
- Chen, P. Y., et al. Endothelial TGF-beta signalling drives vascular inflammation and atherosclerosis. Nature Metabolism. 1, 912-926 (2019).
- Mehlem, A., Hagberg, C. E., Muhl, L., Eriksson, U., Falkevall, A. Imaging of neutral lipids by oil red O for analyzing the metabolic status in health and disease. Nature Protocols. 8, 1149-1154 (2013).
- Ferruzzi, J., Madziva, D., Caulk, A. W., Tellides, G., Humphrey, J. D. Compromised mechanical homeostasis in arterial aging and associated cardiovascular consequences. Biomechanics and Modeling Mechanobiology. 17, 1281-1295 (2018).
