Imagerie et analyse de lésions de l’aorte entière o-colorée à l’huile dans un modèle murin d’hyperlipidémie d’anévrisme
Summary
Ce protocole fournit une procédure étape par étape pour analyser la charge athéroscléreuse chez la souris. Les chercheurs peuvent utiliser ce protocole pour comparer l’abondance, l’emplacement et la taille des lésions athérosclérotiques chez différents animaux.
Abstract
Les souris hyperlipidémiques déficientes en apolipoprotéines E (Apoe) ou en récepteurs de lipoprotéines de basse densité (Ldlr) sont les deux modèles les plus couramment utilisés pour la recherche sur l’athérosclérose. Ils sont utilisés pour étudier l’impact de divers facteurs génétiques et de différents types de cellules sur la formation de lésions athérosclérotiques et pour tester le développement de nouvelles thérapies. L’isolement, l’excision de l’aorte entière et la quantification des lésions athérosclérotiques colorées en O rouge huile sont des méthodes morphométriques de base utilisées pour évaluer la charge athéroscléreuse. L’objectif de ce protocole est de décrire une méthode chirurgicale optimisée, étape par étape, pour disséquer, perfuser-fixer, isoler, colorier, imager et analyser les lésions athérosclérotiques dans les aortes de souris avec de l’huile rouge O. Parce que les lésions athérosclérotiques peuvent se former n’importe où dans tout l’arbre aortique, toute cette méthode de coloration à l’huile d’aorte Red O a l’avantage d’évaluer les plaques chargées de lipides dans toute l’aorte et toutes les branches d’une seule souris. En plus de la coloration Oil Red O, des aortes entières isolées fraîches peuvent être utilisées pour une variété d’expériences in vitro et in vivo et d’isolements cellulaires.
Introduction
La maladie coronarienne, l’une des principales causes de mortalité aux États-Unis, est généralement causée par l’athérosclérose, un processus qui conduit à l’accumulation de plaque à l’intérieur des parois artérielles1. Les souris déficientes en Apoe et en Ldlr sujettes à l’hyperlipidémie sont au cœur des investigations sur l’athérosclérose et ses complications et le développement de thérapies2,3,4,5. La quantification des lésions athérosclérotiques d’une aorte en face est une analyse de critère importante pour évaluer l’impact de la manipulation génétique dans différents types de cellules. Il aide également à étudier de nouvelles thérapies conçues pour affecter l’initiation, la progression et la régression de la maladie athéroscléreuse. Des lésions athérosclérotiques peuvent se former n’importe où dans l’aorte et ses branches (c.-à-d. les artères brachiocéphales, carotides et sous-clavières dans la poitrine, ainsi que les artères rénales, iliaques et fémorales communes sous le diaphragme)6. Une évaluation complète du fardeau de l’athérosclérose et un traitement approprié nécessitent une évaluation du fardeau de la maladie dans différents endroits, un défi qui est souvent négligé.
Ce protocole décrit comment effectuer une analyse complète des lésions athérosclérotiques, en commençant par une aorte entière non ouverte et en procédant à la préparation du visage, chez une seule souris. La coloration à l’huile d’aorte rouge rouge non ouverte permet une évaluation qualitative rapide des plaques chargées de lipides dans l’ensemble de l’aorte et de ses branches, tandis que la préparation du visage fournit une évaluation quantitative de la distribution des lésions athérosclérotiques dans l’aorte de la souris.
La technique utilise des souris âgées de 8 semaines avec une délétion TGFβR2 spécifique aux cellules musculaires lisses sur le fond hyperlipidémique Apoe-/- (MYH11-CreERT2; Tgfbr2f/f;mT/mGf/f; Apoe-/-; ci-après dénommées souris TGFβR2iSMC-Apoe) et témoins Apoe-/- de litière (MYH11-CreERT2;mT/mGf/f; Apoe-/-; ci-après dénommées souris Apoe-/- ). Les animaux sont gardés pendant 16 semaines dans un régime riche en cholestérol et en graisses (HCHFD) comme matériel d’étude7. À la fin de l’étude, les aortes entières non ouvertes sont colorées et imagées (y compris toutes les branches principales) avec de l’O rouge huileux pour une évaluation qualitative des plaques chargées de lipides. Les aortes sont ouvertes par préparation du visage et toutes les lésions athérosclérotiques sont imagées et quantifiées. Ce protocole peut être utilisé pour étudier le développement de lésions athérosclérotiques dans des modèles de souris hyperlipidémiques Apoe-/– ou Ldlr-/- et étendu aux applications générales de biologie vasculaire liées à l’aorte.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les souris déficientes en apolipoprotéines E (Apoe) et en récepteurs de lipoprotéines de basse densité (Ldlr) sont utiles pour étudier le développement et le traitement de l’athérosclérose. Les chercheurs peuvent évaluer l’impact de la génétique et des manipulations thérapeutiques sur l’initiation, la progression et la régression des maladies liées à l’athérosclérose en utilisant la coloration à l’huile rouge O de l’ensemble de l’aorte9. La colora…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu, en partie, par une microsubvention du Consortium conjoint de biologie fournie dans le cadre de la subvention des NIH P30AR070253 (P.-Y.C.) et HL135582 (M.S.). Nous sommes reconnaissants à R. Webber et L. Coon d’avoir maintenu les souris utilisées dans cette étude.
Materials
| 1.5 mL Eppendorf tube | DENVILLE | C2170 | |
| 10 mL syringe | BD | 302995 | |
| 16% Formaldehyde | Polysciences | 18814-10 | |
| 70% ethanol | VWR | RC2546.70-5 | To clean the dissection tools |
| Black dissection wax | CR Scientific | C3541 | |
| Corn oil | Sigma | C8267 | Solvent for Tamoxifen |
| DNeasy Blood & Tissue kit | QIAGEN | 69506 | To isolate DNA from mouse ear |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered saline (1X DPBS), pH 7.4 | Gibco | 14190-144 | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | To cut the mouse skin and open the ribcage |
| Fisherbrand Economy Plain Glass Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | |
| High cholesterol high fat diet | Research Diets | D12108 | To induce atherosclerosis |
| Imaging software | National Institutes of Health | Image J | Aortic lesion quantification |
| Isopropanol | VWR | JT9079-5 | |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | To clean the glass microscope slides |
| McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors | ROBOZ | RS-5602 | To separate the heart and the aorta and to cut open the aorta and aorta branches |
| Microscope control software | Olympus | DP Controller | For aorta imaging |
| Minutien pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Needle-25G | BD | 305124 | |
| NonWoven Sponge | McKesson | 94442000 | |
| Oil Red O | Sigma | O-0625 | To stain the atherosclerosis lesions |
| Pall Acrodisc Sterile Syringe Filters with Super Membrane | VWR | 28143-312 | To filter working Oil Red O solution |
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15021-15 | To dissect and clean the aorta |
| Statistical software | GraphPad | Prism 8 | Statical analysis |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | For aorta dissection |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | For aorta imaging |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | To induce Cre-loxP recombination |
| Tissue-Tek O.C.T Compound, Sakura Finetek | VWR | 25608-930 | |
| Tweezer Style 4 | Electron Microscopy Sciences | 0302-4-PO | To cut the mouse skin and open the ribcage |
| Tweezer Style 5 | Electron Microscopy Sciences | 0302-5-PO | To dissect and clean the aorta |
Referências
- Lusis, A. J. Atherosclerosis. Nature. 407, 233-241 (2000).
- Emini Veseli, B., et al. Animal models of atherosclerosis. European Journal of Pharmacology. 816, 3-13 (2017).
- Plump, A. S., et al. Severe hypercholesterolemia and atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice created by homologous recombination in ES cells. Cell. 71, 343-353 (1992).
- Zhang, S. H., Reddick, R. L., Piedrahita, J. A., Maeda, N. Spontaneous hypercholesterolemia and arterial lesions in mice lacking apolipoprotein E. Science. 258, 468-471 (1992).
- Ishibashi, S., et al. Hypercholesterolemia in low density lipoprotein receptor knockout mice and its reversal by adenovirus-mediated gene delivery. Journal of Clinical Investigation. 92, 883-893 (1993).
- Nakashima, Y., Plump, A. S., Raines, E. W., Breslow, J. L., Ross, R. ApoE-deficient mice develop lesions of all phases of atherosclerosis throughout the arterial tree. Arteriosclerosis Thrombosis. 14, 133-140 (1994).
- Chen, P. Y., et al. Smooth muscle cell reprogramming in aortic aneurysms. Cell Stem Cell. 26, 542-557 (2020).
- Andres-Manzano, M. J., Andres, V., Dorado, B. Oil Red O and Hematoxylin and Eosin Staining for Quantification of Atherosclerosis Burden in Mouse Aorta and Aortic Root. Methods in Molecular Biology. 1339, 85-99 (2015).
- Chen, P. Y., et al. Endothelial TGF-beta signalling drives vascular inflammation and atherosclerosis. Nature Metabolism. 1, 912-926 (2019).
- Mehlem, A., Hagberg, C. E., Muhl, L., Eriksson, U., Falkevall, A. Imaging of neutral lipids by oil red O for analyzing the metabolic status in health and disease. Nature Protocols. 8, 1149-1154 (2013).
- Ferruzzi, J., Madziva, D., Caulk, A. W., Tellides, G., Humphrey, J. D. Compromised mechanical homeostasis in arterial aging and associated cardiovascular consequences. Biomechanics and Modeling Mechanobiology. 17, 1281-1295 (2018).
