Bildgebung und Analyse von ölrot-o-gefärbten ganzen Aortenläsionen in einem Aneurysma-Hyperlipidämie-Mausmodell
Summary
Dieses Protokoll bietet eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Analyse der atherosklerotischen Belastung bei Mäusen. Ermittler können dieses Protokoll verwenden, um die Häufigkeit, den Ort und die Größe von atherosklerotischen Läsionen bei verschiedenen Tieren zu vergleichen.
Abstract
Apolipoprotein E (Apoe)- oder Low Density Lipoprotein Receptor (Ldlr)-defiziente hyperlipidämische Mäuse sind die beiden am häufigsten verwendeten Modelle für die Atheroskleroseforschung. Sie werden verwendet, um den Einfluss verschiedener genetischer Faktoren und verschiedener Zelltypen auf die atherosklerotische Läsionsbildung zu untersuchen und die Entwicklung neuer Therapien zu testen. Isolierung, Exzision der gesamten Aorta und Quantifizierung von Oil Red O-gefärbten atherosklerotischen Läsionen sind grundlegende morphometrische Methoden zur Bewertung der atherosklerotischen Belastung. Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine optimierte, schrittweise chirurgische Methode zu beschreiben, um atherosklerotische Läsionen in Mausaorten mit Oil Red O zu sezieren, zu fixieren, zu isolieren, zu färben, abzubilden und zu analysieren. Da sich atherosklerotische Läsionen überall im gesamten Aortenbaum bilden können, hat diese gesamte Aorta-Öl-Rot-O-Färbemethode den Vorteil, dass lipidbeladene Plaques in der gesamten Aorta und allen Zweigen in einer einzigen Maus bewertet werden. Zusätzlich zur Öl-Rot-O-Färbung können frisch isolierte ganze Aorten für eine Vielzahl von In-vitro- und In-vivo-Experimenten und Zellisolierungen verwendet werden.
Introduction
Koronare Herzkrankheit, eine der Haupttodesursachen in den USA, wird in der Regel durch Atherosklerose verursacht, ein Prozess, der zur Bildung von Plaque in den Arterienwänden führt1. Hyperlipidämie-anfällige Apoe- und Ldlr-defiziente Mäuse sind von zentraler Bedeutung für die Untersuchung von Atherosklerose und ihren Komplikationen und die Entwicklung von Therapien2,3,4,5. Die Quantifizierung atherosklerotischer Läsionen aus einer En-face-Aorta ist eine wichtige Endpunktanalyse zur Bewertung der Auswirkungen genetischer Manipulation in verschiedenen Zelltypen. Es hilft auch, neuartige Therapien zu untersuchen, die die Initiierung, Progression und Regression atherosklerotischer Erkrankungen beeinflussen sollen. Atherosklerotische Läsionen können sich überall in der Aorta und ihren Ästen bilden (d. h. brachiozephalis, Halsschlagadern und Subclavia-Arterien in der Brust sowie Nieren-, gemeinsame Becken- und Oberschenkelarterien unterhalb des Zwerchfells)6. Eine umfassende Bewertung der Atherosklerosebelastung und eine geeignete Therapie erfordern eine Beurteilung der Krankheitslast an verschiedenen Orten, eine Herausforderung, die oft übersehen wird.
Dieses Protokoll beschreibt, wie eine umfassende Analyse von atherosklerotischen Läsionen, beginnend mit einer ungeöffneten ganzen Aorta und bis zur Vorbereitung des Gesichts, in einer einzigen Maus durchgeführt wird. Die ungeöffnete Färbung der gesamten Aorta Oil Red O ermöglicht eine schnelle, qualitative Beurteilung von lipidbeladenen Plaques in der gesamten Aorta und ihren Ästen, während die Flächenvorbereitung eine quantitative Beurteilung der atherosklerotischen Läsionsverteilung in der Mausaorta ermöglicht.
Die Technik verwendet 8 Wochen alte Mäuse mit einer glatten Muskelzell-spezifischen TGFβR2-Deletion auf dem Apoe-/- hyperlipidämischen Hintergrund (MYH11-CreERT2; Tgfbr2f/f;mT/mGf/f; Apoe–/-; im Folgenden als TGFβR2iSMC-Apoe-Mäuse bezeichnet) und Littermate Apoe-/- Kontrollen (MYH11-CreERT2;mT/mGf/f; Apoe–/-; im Folgenden als Apoe-/- Mäuse bezeichnet). Die Tiere werden 16 Wochen lang mit einer cholesterinreichen fettreichen Diät (HCHFD) als Studienmaterial gehalten7. Am Ende der Studie werden die ungeöffneten ganzen Aorten gefärbt und (einschließlich aller Hauptzweige) mit Oil Red O zur qualitativen Beurteilung von lipidbeladenen Plaques abgebildet. Die Aorten werden durch En-Face-Vorbereitung aufgeschnitten und alle atherosklerotischen Läsionen werden abgebildet und quantifiziert. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die atherosklerotische Läsionsentwicklung in Apoe-/- oder Ldlr-/- Hyperlipidämie-Mäusemodellen zu untersuchen und auf allgemeine aortabezogene vaskuläre Biologieanwendungen auszudehnen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Apolipoprotein E (Apoe) und Low Density Lipoprotein Rezeptor (Ldlr) defiziente Mäuse sind nützlich für die Untersuchung der Entwicklung und Behandlung von Atherosklerose. Forscher können die Auswirkungen von Genetik und therapeutischen Manipulationen auf die Initiierung, Progression und Regression von Atherosklerose-bedingten Krankheiten unter Verwendung der Öl-Rot-O-Färbung der gesamten Aorta bewerten9. Aorta Oil Red O Färbung und Läsionsquantifizierung ist der Goldstand…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde zum Teil durch einen Joint Biology Consortium Microgrant unterstützt, der im Rahmen des NIH-Zuschusses P30AR070253 (P.-Y.C.) und HL135582 (M.S.) bereitgestellt wurde. Wir danken R. Webber und L. Coon für die Aufrechterhaltung der in dieser Studie verwendeten Mäuse.
Materials
| 1.5 mL Eppendorf tube | DENVILLE | C2170 | |
| 10 mL syringe | BD | 302995 | |
| 16% Formaldehyde | Polysciences | 18814-10 | |
| 70% ethanol | VWR | RC2546.70-5 | To clean the dissection tools |
| Black dissection wax | CR Scientific | C3541 | |
| Corn oil | Sigma | C8267 | Solvent for Tamoxifen |
| DNeasy Blood & Tissue kit | QIAGEN | 69506 | To isolate DNA from mouse ear |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered saline (1X DPBS), pH 7.4 | Gibco | 14190-144 | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | To cut the mouse skin and open the ribcage |
| Fisherbrand Economy Plain Glass Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | |
| High cholesterol high fat diet | Research Diets | D12108 | To induce atherosclerosis |
| Imaging software | National Institutes of Health | Image J | Aortic lesion quantification |
| Isopropanol | VWR | JT9079-5 | |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | To clean the glass microscope slides |
| McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors | ROBOZ | RS-5602 | To separate the heart and the aorta and to cut open the aorta and aorta branches |
| Microscope control software | Olympus | DP Controller | For aorta imaging |
| Minutien pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Needle-25G | BD | 305124 | |
| NonWoven Sponge | McKesson | 94442000 | |
| Oil Red O | Sigma | O-0625 | To stain the atherosclerosis lesions |
| Pall Acrodisc Sterile Syringe Filters with Super Membrane | VWR | 28143-312 | To filter working Oil Red O solution |
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15021-15 | To dissect and clean the aorta |
| Statistical software | GraphPad | Prism 8 | Statical analysis |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | For aorta dissection |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | For aorta imaging |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | To induce Cre-loxP recombination |
| Tissue-Tek O.C.T Compound, Sakura Finetek | VWR | 25608-930 | |
| Tweezer Style 4 | Electron Microscopy Sciences | 0302-4-PO | To cut the mouse skin and open the ribcage |
| Tweezer Style 5 | Electron Microscopy Sciences | 0302-5-PO | To dissect and clean the aorta |
Referências
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- Emini Veseli, B., et al. Animal models of atherosclerosis. European Journal of Pharmacology. 816, 3-13 (2017).
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- Ishibashi, S., et al. Hypercholesterolemia in low density lipoprotein receptor knockout mice and its reversal by adenovirus-mediated gene delivery. Journal of Clinical Investigation. 92, 883-893 (1993).
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