動脈瘤高脂血症マウスモデルにおけるオイルレッドO染色全大動脈病変のイメージングと解析
Summary
このプロトコルは 、マウスにおけるアテローム性動脈硬化負荷を分析するためのステップバイステップの手順を提供する。研究者は、このプロトコルを使用して、異なる動物におけるアテローム性動脈硬化病変の存在量、位置、およびサイズを比較することができる。
Abstract
アポリポタンパク質E(Apoe)-または低密度リポタンパク質受容体(Ldlr)欠損高脂血症マウスは、アテローム性動脈硬化症研究に最も一般的に使用される2つのモデルである。それらは、アテローム性動脈硬化病変形成に対する様々な遺伝的要因および異なる細胞型の影響を研究し、ならびに新しい治療法の開発をテストするために使用される。大動脈全体の単離、切除、およびオイルレッドO染色されたアテローム性動脈硬化病変の定量化は、アテローム性動脈硬化負荷を評価するために使用される基本的な形態測定法である 。このプロトコルの目標は、Oil Red Oを用いてマウス大動脈のアテローム性動脈硬化病変を解剖、灌流固定、単離、染色、画像化、分析するための最適化された段階的な外科的方法を記述することです。無気球硬化性病変は大動脈樹全体のどこにでも形成され得るので、この大動脈全体オイルレッドO染色法は、大動脈全体およびすべての枝の脂質を含むプラークを単一のマウスで評価するという利点を有する。オイルレッドO染色に加えて、新鮮な単離された全大動脈は、様々なインビトロおよびインビボ実験および細胞単離に使用することができる。
Introduction
米国における主要な死因である冠状動脈疾患は、通常、動脈壁内部のプラークの蓄積につながるアテローム性動脈硬化症によって引き起こされます1。高脂血症を起こしやすいApoeおよびLdlr欠損マウスは、アテローム性動脈硬化症およびその合併症の調査および治療法の開発の中心である2,3,4,5。エンフェイス大動脈からのアテローム性動脈硬化病変の定量化は、異なる細胞型における遺伝子操作の影響を評価するための重要なエンドポイント分析である。また、アテローム性動脈硬化性疾患の開始、進行、および退行に影響を与えるように設計された新しい治療法の研究にも役立ちます。アテローム性動脈硬化病変は、大動脈およびその枝(すなわち、胸部の腕頭症、頸動脈および鎖骨下動脈、ならびに横隔膜の下の腎動脈、総腸骨動脈および大腿動脈)のどこにでも形成され得る6。アテローム性動脈硬化症の負担と適切な治療の包括的な評価は、異なる場所での疾患負担の評価を必要とし、しばしば見過ごされがちな課題である。
このプロトコルは、未開封の大動脈全体から始まり、顔面調製に進むアテローム性動脈硬化病変の包括的な分析を単一のマウスで行う方法を説明しています。未開封の大動脈全部オイルレッドO染色は、大動脈全体およびその枝における脂質を含んだプラークの迅速で定性的な評価を可能にし、一方、顔面調製は、マウス大動脈におけるアテローム性動脈硬化病変分布の定量的評価を提供する。
この技術は、Apoe-/-高脂血症バックグラウンド上の平滑筋細胞特異的TGFβR2欠失を有する8週齢のマウスを使用する(MYH11-CreERT2;Tgfbr2f/f;mT/mGf/f;アポエ–/-;以下、TGFβR2iSMC-Apoeマウスという)および同腹仔のApoe-/-コントロール(MYH11-CreERT2;mT/mGf/f;アポエ–/-;以下、アポエ-/-マウスという)。動物は、研究材料として高コレステロール高脂肪食(HCHFD)で16週間飼育されています7。研究終了時に、未開封の大動脈全体をオイルレッドOで染色および画像化し、脂質を含んだプラークの定性的評価を行う。大動脈は、顔面準備によって切り開かれ、すべてのアテローム性動脈硬化病変が画像化され、定量化される。このプロトコールは、Apoe-/-またはLdlr-/-高脂血症マウスモデルにおけるアテローム性動脈硬化病変の発症を研究するために使用でき、一般的な大動脈関連血管生物学アプリケーションに拡張することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
アポリポタンパク質E(Apoe)および低密度リポタンパク質受容体(Ldlr)欠損マウスは、アテローム性動脈硬化症の発生および治療の研究に有用である。研究者は、大動脈全体のオイルレッドO染色を用いて、アテローム性動脈硬化症関連疾患の開始、進行、および退行に対する遺伝学および治療操作の影響を評価することができます9。大動脈オイルレッドO染色および…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、NIH助成金P30AR070253(P.-Y.)およびHL135582(M.S.)の下で提供された共同生物学コンソーシアムマイクログラントによって部分的に支援され.C。我々は、この研究で使用されたマウスを維持してくれたR. WebberとL. Coonに感謝する。
Materials
| 1.5 mL Eppendorf tube | DENVILLE | C2170 | |
| 10 mL syringe | BD | 302995 | |
| 16% Formaldehyde | Polysciences | 18814-10 | |
| 70% ethanol | VWR | RC2546.70-5 | To clean the dissection tools |
| Black dissection wax | CR Scientific | C3541 | |
| Corn oil | Sigma | C8267 | Solvent for Tamoxifen |
| DNeasy Blood & Tissue kit | QIAGEN | 69506 | To isolate DNA from mouse ear |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered saline (1X DPBS), pH 7.4 | Gibco | 14190-144 | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | To cut the mouse skin and open the ribcage |
| Fisherbrand Economy Plain Glass Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | |
| High cholesterol high fat diet | Research Diets | D12108 | To induce atherosclerosis |
| Imaging software | National Institutes of Health | Image J | Aortic lesion quantification |
| Isopropanol | VWR | JT9079-5 | |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | To clean the glass microscope slides |
| McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors | ROBOZ | RS-5602 | To separate the heart and the aorta and to cut open the aorta and aorta branches |
| Microscope control software | Olympus | DP Controller | For aorta imaging |
| Minutien pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Needle-25G | BD | 305124 | |
| NonWoven Sponge | McKesson | 94442000 | |
| Oil Red O | Sigma | O-0625 | To stain the atherosclerosis lesions |
| Pall Acrodisc Sterile Syringe Filters with Super Membrane | VWR | 28143-312 | To filter working Oil Red O solution |
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15021-15 | To dissect and clean the aorta |
| Statistical software | GraphPad | Prism 8 | Statical analysis |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | For aorta dissection |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | For aorta imaging |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | To induce Cre-loxP recombination |
| Tissue-Tek O.C.T Compound, Sakura Finetek | VWR | 25608-930 | |
| Tweezer Style 4 | Electron Microscopy Sciences | 0302-4-PO | To cut the mouse skin and open the ribcage |
| Tweezer Style 5 | Electron Microscopy Sciences | 0302-5-PO | To dissect and clean the aorta |
Referências
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- Emini Veseli, B., et al. Animal models of atherosclerosis. European Journal of Pharmacology. 816, 3-13 (2017).
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- Ishibashi, S., et al. Hypercholesterolemia in low density lipoprotein receptor knockout mice and its reversal by adenovirus-mediated gene delivery. Journal of Clinical Investigation. 92, 883-893 (1993).
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