Anevrizma Hiperlipidemi Fare Modelinde Yağ Kırmızı O-Boyalı Bütün Aort Lezyonlarının Görüntülenmesi ve Analizi
Summary
Bu protokol, farelerde aterosklerotik yükü analiz etmek için adım adım bir prosedür sağlar. Araştırmacılar bu protokolü farklı hayvanlardaki aterosklerotik lezyonların bolluğunu, yerini ve boyutunu karşılaştırmak için kullanabilirler.
Abstract
Apolipoprotein E (Apoe) veya düşük yoğunluklu lipoprotein reseptörü (Ldlr) eksikliği olan hiperlipidemik fareler, ateroskleroz araştırması için en sık kullanılan iki modeldir. Çeşitli genetik faktörlerin ve farklı hücre tiplerinin aterosklerotik lezyon oluşumu üzerindeki etkisini incelemek ve yeni tedavilerin gelişimini test etmek için kullanılırlar. Tüm aortun izolasyonu, eksizyonu ve Yağ Kırmızı O boyalı aterosklerotik lezyonların miktarının belirlenmesi aterosklerotik yükü değerlendirmek için kullanılan temel morfometrik yöntemlerdir . Bu protokolün amacı, Oil Red O ile fare aortlarındaki aterosklerotik lezyonları diseke etmek, perfüzyon-fix, izole etmek, boyamak, görüntülemek ve analiz etmek için optimize edilmiş, adım adım cerrahi bir yöntemi tanımlamaktır. Aterosklerotik lezyonlar tüm aort ağacının herhangi bir yerinde oluşabildiğinden, tüm bu aort Yağı Kırmızı O boyama yöntemi, tüm aorttaki lipit yüklü plakları ve tüm dalları tek bir farede değerlendirme avantajına sahiptir. Yağ Kırmızı O boyamasına ek olarak, taze izole edilmiş bütün aortlar çeşitli in vitro ve in vivo deneyler ve hücre izolasyonları için kullanılabilir.
Introduction
ABD’de önde gelen bir mortalite nedeni olan koroner arter hastalığına genellikle arteriyel duvarların içinde plak birikmesine yol açan bir süreç olan ateroskleroz neden olur1. Hiperlipidemiye eğilimli Apee ve Ldlr eksikliği olan fareler, ateroskleroz ve komplikasyonlarının araştırılmasında ve tedavilerin geliştirilmesinde merkezidir2,3,4,5. Aterosklerotik lezyonların en face aorttan nicelleştirilmesi, farklı hücre tiplerinde genetik manipülasyonun etkisini değerlendirmek için önemli bir son nokta analizidir. Ayrıca, aterosklerotik hastalığın başlamasını, ilerlemesini ve regresyonunu etkilemek için tasarlanmış yeni tedavilerin incelenmesine yardımcı olur. Aterosklerotik lezyonlar aort ve dallarının herhangi bir yerinde oluşabilir (yani, göğüsteki brakiyosefalik, karotis ve subklaviyen arterlerin yanı sıra diyaframın altındaki böbrek, yaygın iliak ve femoral arterler)6. Ateroskleroz yükünün kapsamlı bir şekilde değerlendirilmesi ve uygun tedavi, farklı yerlerdeki hastalık yükünün değerlendirilmesini gerektirir ve bu da genellikle göz ardı edilen bir zorluktur.
Bu protokol, açılmamış bir bütün aort ile başlayıp yüz hazırlığına kadar ilerleyen aterosklerotik lezyonların kapsamlı bir analizinin tek bir farede nasıl yapılacağını açıklar. Açılmamış bütün aort Yağı Kırmızı O boyaması, tüm aort ve dallarındaki lipit yüklü plakların hızlı, kalitatif bir şekilde değerlendirilmesini sağlarken, en yüz hazırlığı fare aortundaki aterosklerotik lezyon dağılımının nicel bir değerlendirmesini sağlar.
Teknik, Apoe-/– hiperlipidemik arka plan üzerinde düz kas hücresine özgü TGFβR2 delesyonuna sahip 8 haftalık fareleri kullanır (MYH11-CreERT2; Tgfbr2f/f;mT/mGf/f; Apoe–/-; bundan böyle TGFβR2iSMC-Apoe fareleri olarak anılacaktır) ve çöp arkadaşı Apoe-/- kontrolleri (MYH11-CreERT2;mT/mGf/f; Apoe–/-; bundan böyle Apoe-/- fareler olarak anılacaktır). Hayvanlar, çalışma materyalleri olarak yüksek kolesterollü yüksek yağlı bir diyette (HCHFD) 16 hafta boyunca tutulur7. Çalışma sonlandırma sırasında, açılmamış bütün aortlar, lipid yüklü plakların kalitatif değerlendirmesi için Yağ Kırmızı O ile boyanır ve görüntülenir (tüm ana dallar dahil). Aortlar en yüz hazırlığı ile kesilir ve tüm aterosklerotik lezyonlar görüntülenir ve ölçülür. Bu protokol, Apoe-/- veya Ldlr-/- hiperlipidemi fare modellerinde aterosklerotik lezyon gelişimini incelemek için kullanılabilir ve genel aortla ilişkili vasküler biyoloji uygulamalarına genişletilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Apolipoprotein E (Apoe) ve düşük yoğunluklu lipoprotein reseptörü (Ldlr) eksikliği olan fareler, aterosklerozun gelişimini ve tedavisini incelemek için yararlıdır. Araştırmacılar, genetik ve terapötik manipülasyonların, tüm aortun Yağ Kırmızı O boyamasını kullanarak aterosklerozla ilişkili hastalıkların başlaması, ilerlemesi ve regresyonu üzerindeki etkisini değerlendirebilirler9. Aort Yağı Kırmızı O boyama ve lezyon miktarının belirlenmesi a…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, kısmen, NIH hibesi P30AR070253 (P.-Y.C.) ve HL135582 (MS) kapsamında sağlanan Ortak Biyoloji Konsorsiyumu Microgrant tarafından desteklenmiştir. Bu çalışmada kullanılan fareleri korudukları için R. Webber ve L. Coon’a minnettarız.
Materials
| 1.5 mL Eppendorf tube | DENVILLE | C2170 | |
| 10 mL syringe | BD | 302995 | |
| 16% Formaldehyde | Polysciences | 18814-10 | |
| 70% ethanol | VWR | RC2546.70-5 | To clean the dissection tools |
| Black dissection wax | CR Scientific | C3541 | |
| Corn oil | Sigma | C8267 | Solvent for Tamoxifen |
| DNeasy Blood & Tissue kit | QIAGEN | 69506 | To isolate DNA from mouse ear |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered saline (1X DPBS), pH 7.4 | Gibco | 14190-144 | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | To cut the mouse skin and open the ribcage |
| Fisherbrand Economy Plain Glass Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | |
| High cholesterol high fat diet | Research Diets | D12108 | To induce atherosclerosis |
| Imaging software | National Institutes of Health | Image J | Aortic lesion quantification |
| Isopropanol | VWR | JT9079-5 | |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | To clean the glass microscope slides |
| McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors | ROBOZ | RS-5602 | To separate the heart and the aorta and to cut open the aorta and aorta branches |
| Microscope control software | Olympus | DP Controller | For aorta imaging |
| Minutien pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Needle-25G | BD | 305124 | |
| NonWoven Sponge | McKesson | 94442000 | |
| Oil Red O | Sigma | O-0625 | To stain the atherosclerosis lesions |
| Pall Acrodisc Sterile Syringe Filters with Super Membrane | VWR | 28143-312 | To filter working Oil Red O solution |
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15021-15 | To dissect and clean the aorta |
| Statistical software | GraphPad | Prism 8 | Statical analysis |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | For aorta dissection |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | For aorta imaging |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | To induce Cre-loxP recombination |
| Tissue-Tek O.C.T Compound, Sakura Finetek | VWR | 25608-930 | |
| Tweezer Style 4 | Electron Microscopy Sciences | 0302-4-PO | To cut the mouse skin and open the ribcage |
| Tweezer Style 5 | Electron Microscopy Sciences | 0302-5-PO | To dissect and clean the aorta |
Referências
- Lusis, A. J. Atherosclerosis. Nature. 407, 233-241 (2000).
- Emini Veseli, B., et al. Animal models of atherosclerosis. European Journal of Pharmacology. 816, 3-13 (2017).
- Plump, A. S., et al. Severe hypercholesterolemia and atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice created by homologous recombination in ES cells. Cell. 71, 343-353 (1992).
- Zhang, S. H., Reddick, R. L., Piedrahita, J. A., Maeda, N. Spontaneous hypercholesterolemia and arterial lesions in mice lacking apolipoprotein E. Science. 258, 468-471 (1992).
- Ishibashi, S., et al. Hypercholesterolemia in low density lipoprotein receptor knockout mice and its reversal by adenovirus-mediated gene delivery. Journal of Clinical Investigation. 92, 883-893 (1993).
- Nakashima, Y., Plump, A. S., Raines, E. W., Breslow, J. L., Ross, R. ApoE-deficient mice develop lesions of all phases of atherosclerosis throughout the arterial tree. Arteriosclerosis Thrombosis. 14, 133-140 (1994).
- Chen, P. Y., et al. Smooth muscle cell reprogramming in aortic aneurysms. Cell Stem Cell. 26, 542-557 (2020).
- Andres-Manzano, M. J., Andres, V., Dorado, B. Oil Red O and Hematoxylin and Eosin Staining for Quantification of Atherosclerosis Burden in Mouse Aorta and Aortic Root. Methods in Molecular Biology. 1339, 85-99 (2015).
- Chen, P. Y., et al. Endothelial TGF-beta signalling drives vascular inflammation and atherosclerosis. Nature Metabolism. 1, 912-926 (2019).
- Mehlem, A., Hagberg, C. E., Muhl, L., Eriksson, U., Falkevall, A. Imaging of neutral lipids by oil red O for analyzing the metabolic status in health and disease. Nature Protocols. 8, 1149-1154 (2013).
- Ferruzzi, J., Madziva, D., Caulk, A. W., Tellides, G., Humphrey, J. D. Compromised mechanical homeostasis in arterial aging and associated cardiovascular consequences. Biomechanics and Modeling Mechanobiology. 17, 1281-1295 (2018).
