Aplicación de un sistema de biorreactor de estimulación mecánica uniaxial tridimensional para inducir la diferenciación tenogénica de células madre derivadas del tendón
Summary
Un sistema de biorreactor de estimulación mecánica uniaxial tridimensional es un biorreactor ideal para la diferenciación tenogénica específica de las células madre derivadas del tendón y la formación de neo tendones.
Abstract
La tendinopatía es una enfermedad del tendón crónico común relacionada con la inflamación y la degeneración en un área ortopédica. Con alta morbilidad, capacidad de autorreparación limitada y, lo que es más importante, sin tratamientos definitivos, la tendinopatía todavía influye negativamente en la calidad de vida de los pacientes. Las células madre derivadas del tendón (TDSC), como células precursoras primarias de las células tendones, desempeñan un papel esencial tanto en el desarrollo de la tendinopatía como en la restauración funcional y estructural después de la tendinopatía. Por lo tanto, un método que puede imitar in vitro la diferenciación in vivo de los ETDSC en las células tendinosas sería útil. Aquí, el presente protocolo describe un método basado en un sistema de estiramiento uniaxial tridimensional (3D) para estimular a los TDSC a diferenciarse en tejidos similares a los tendones. Existen siete etapas del presente protocolo: aislamiento de ratones TDSC, cultivo y expansión de ratones TDSC, preparación de medio de cultivo de estimulación para la formación de láminas celulares, formación de láminas celulares mediante cultivo en medio de estimulación, preparación de la construcción de células madre del tendón 3D, montaje del complejo de estimulación mecánica de estiramiento uniaxial, y evaluación del tejido mecánico estimulado en forma de tendón in vitro. La eficacia fue demostrada por la histología. Todo el procedimiento toma menos de 3 semanas. Para promover la deposición de matriz extracelular, se utilizó 4,4 mg/ml de ácido ascórbico en el medio de cultivo de estimulación. Una cámara separada con un motor lineal proporciona una carga mecánica precisa y es portátil y se ajusta fácilmente, que se aplica para el biorreactor. El régimen de carga en el presente protocolo fue 6% cepa, 0,25 Hz, 8 h, seguido de 16 h de descanso durante 6 días. Este protocolo podría imitar la diferenciación celular en el tendón, lo cual es útil para la investigación del proceso patológico de tendinopatía. Por otra parte, el tejido similar al tendón se utiliza potencialmente para promover la cicatrización del tendón en la lesión del tendón como un injerto autólogo diseñado. En resumen, el presente protocolo es simple, económico, reproducible y válido.
Introduction
La tendinopatía es una de las lesiones deportivas comunes. Se manifiesta principalmente por el dolor, hinchazón local, disminución de la tensión muscular en la zona afectada, y disfunción. La incidencia de tendinopatía es alta. La presencia de tendinopatía de Aquiles es más común para los corredores de media y larga distancia (hasta 29%), mientras que la presencia de tendinopatía rotuliana también es alta en los atletas de voleibol (45%), baloncesto (32%), pista y campo (23%), balonmano (15%), y fútbol (13%)1,,2,3,,4,5. Sin embargo, debido a la limitada capacidad de autocuración del tendón, y la falta de tratamientos eficaces, la tendinopatía todavía influye en la vida de los pacientes negativamente6,7. Además, la patogénesis de la tendinopatía sigue sin estar clara. Ha habido muchas investigaciones sobre su patogénesis, incluyendo principalmente “teoría de la inflamación”, “teoría de la degeneración”, “teoría del uso excesivo”, y así sucesivamente8. En la actualidad, muchos investigadores creían que la tendinopatía se debía a la reparera fallida de las microlesiones causadas por la carga mecánica excesiva del tendón experimenta9,,10.
Las células madre derivadas del tendón (TDSC), como células precursoras primarias de las células tendonesas, desempeñan un papel esencial tanto en el desarrollo de la tendinopatía como en la restauración funcional y estructural después de la tendinopatía11,12,13. Se informó que la estimulación mecánica del estrés podría causar la proliferación y diferenciación de osteocitos, osteoblastos, células musculares lisas, fibroblastos, células madre mesenquimales y otras células sensibles a la fuerza14,15,16,17,18. Por lo tanto, los TDSC, como una de las células mecanósensibles y multipotentes, pueden ser estimulados de manera similar para diferenciar por carga mecánica19,20.
Sin embargo, diferentes parámetros de carga mecánica (fuerza de carga, frecuencia de carga, tipo de carga y período de carga) pueden inducir a los TDSC a diferenciarse en diferentes celdas21. Por lo tanto, un régimen de carga mecánica eficaz y válido es muy significativo para la tenogénesis. Además, existen diferentes tipos de biorreactores como sistemas de estimulación utilizados actualmente para proporcionar carga mecánica a los TDSC. Los principios de cada tipo de biorreactor son diferentes, por lo que los parámetros de carga mecánica correspondientes a diferentes biorreactores también son diferentes. Por lo tanto, se demanda un protocolo de estimulación simple, económico y reproducible, incluyendo el tipo de biorreactor, el medio de estimulación correspondiente y el régimen de carga mecánica.
El presente artículo describe un método basado en un sistema de estiramiento uniaxial tridimensional (3D) para estimular a los TDSC a diferenciarse en tejido similar al tendón. Hay siete etapas del protocolo: aislamiento de ratones TDSC, cultivo y expansión de ratones TDSC, preparación de medio de cultivo de estimulación para la formación de láminas celulares, formación de láminas celulares mediante el cultivo en medio de estimulación, preparación de la construcción de células madre del tendón 3D, montaje del complejo de estimulación mecánica de estiramiento uniaxial, y evaluación del tejido mecánico estimulado en forma de tendón in vitro. Todo el procedimiento tarda menos de 3 semanas en obtener la construcción de la célula 3D, que es mucho menor que algunos métodos existentes22,,23. Se ha demostrado que el presente protocolo es capaz de inducir a los ETS para que se diferencien en tejido tendino, y es más fiable que el sistema de estiramiento bidimensional (2D) de uso comúnactual 21. La eficacia fue demostrada por la histología. En definitiva, el presente protocolo es simple, económico, reproducible y válido.
Protocol
Representative Results
Discussion
El tendón es un tejido conectivo fibroso mecanosensible. Según investigaciones anteriores, el exceso de carga mecánica podría conducir a la diferenciación osteogénica de las células madre del tendón, mientras que la carga insuficiente conduciría a una estructura desordenada de la fibra de colágeno durante la diferenciación del tendón21.
Una opinión común es que la clave para un biorreactor ideal es la capacidad de simular el microambiente celular in vitro …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La investigación se llevó a cabo mientras el autor estaba en la recepción de “una beca de tasa internacional de la Universidad de Australia Occidental y un premio de postgrado de la universidad en la Universidad de Australia Occidental”. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81802214).
Materials
| Ascorbic acid | Sigma-aldrich | PHR1008-2G | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibcoä by Life Technologies | 1908361 | |
| Histology processor | Leica | TP 1020 | |
| Minimal Essential Medium (Alpha-MEM) | Gibcoä by Life Technologies | 2003802 | |
| Mouse Tendon Derived Stem Cell | Isolated from Achilles tendons of 6- to 8-wk-old C57BL/6 mice. Then digested with type I collagenase (3 mg/ml; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) for 3 h and passed through a 70 mmcell strainer to yield single-cell suspensions. | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-aldrich | 441244 | |
| Streptomycin and penicillin mixture | Gibcoä by Life Technologies | 15140122 | |
| Three-dimensional Uniaxial Mechanical Stimulation Bioreactor System | Centre of Orthopaedic Translational Research, Medical School, University of Western Australia | Available from the corresponding author upon request. Or make it according to our design* *Wang T, Lin Z, Day RE, et al. Programmable mechanical stimulation influences tendon homeostasis in a bioreactor system. Biotechnol Bioeng. 2013;110(5):1495–1507. doi:10.1002/bit.24809 | |
| Trypsin | Gibcoä by Life Technologies | 1858331 |
Referências
- Knobloch, K., Yoon, U., Vogt, P. M. Acute and overuse injuries correlated to hours of training in master running athletes. Foot & Ankle International. 29 (7), 671-676 (2008).
- Kujala, U. M., Sarna, S., Kaprio, J. Cumulative incidence of achilles tendon rupture and tendinopathy in male former elite athletes. Clinical Journal of Sport Medicine. 15 (3), 133-135 (2005).
- Lian, O. B., Engebretsen, L., Bahr, R. Prevalence of jumper’s knee among elite athletes from different sports: a cross-sectional study. The American Journal of Sports Medicine. 33 (4), 561-567 (2005).
- Zwerver, J., Bredeweg, S. W., vanden Akker-Scheek, I. Prevalence of Jumper’s knee among nonelite athletes from different sports: a cross-sectional survey. The American Journal of Sports Medicine. 39 (9), 1984-1988 (2011).
- van der Worp, H., et al. Risk factors for patellar tendinopathy: a systematic review of the literature. British Journal of Sports Medicine. 45 (5), 446-452 (2011).
- Lopez, R. G. L., Jung, H. -. G. Achilles tendinosis: treatment options. Clinics in Orthopedic Surgery. 7 (1), 1-7 (2015).
- Wren, T. A., Yerby, S. A., Beaupré, G. S., Carter, D. R. Mechanical properties of the human achilles tendon. Clinical Biomechanics. 16 (3), 245-251 (2001).
- Rees, J. D., Wilson, A. M., Wolman, R. L. Current concepts in the management of tendon disorders. Rheumatology. 45 (5), 508-521 (2006).
- Magnan, B., Bondi, M., Pierantoni, S., Samaila, E. The pathogenesis of Achilles tendinopathy: a systematic review. Foot and Ankle Surgery. 20 (3), 154-159 (2014).
- Riley, G. The pathogenesis of tendinopathy. A molecular perspective. Rheumatology. 43 (2), 131-142 (2004).
- Bi, Y., et al. Identification of tendon stem/progenitor cells and the role of the extracellular matrix in their niche. Nature Medicine. 13 (10), 1219-1227 (2007).
- Zhang, J., Wang, J. H. C. BMP-2 mediates PGE(2) -induced reduction of proliferation and osteogenic differentiation of human tendon stem cells. Journal of Orthopaedic Research. 30 (2), 47-52 (2012).
- Chen, L., et al. Synergy of tendon stem cells and platelet-rich plasma in tendon healing. Journal of Orthopaedic Research. 30 (6), 991-997 (2012).
- Wang, J., et al. Mechanical stimulation orchestrates the osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells by regulating HDAC1. Cell Death & Disease. 7 (5), 2221 (2016).
- Parvizi, M., Bolhuis-Versteeg, L. A. M., Poot, A. A., Harmsen, M. C. Efficient generation of smooth muscle cells from adipose-derived stromal cells by 3D mechanical stimulation can substitute the use of growth factors in vascular Tissue Engineeringineering. Biotechnology Journal. 11 (7), 932-944 (2016).
- Sun, L., et al. Effects of Mechanical Stretch on Cell Proliferation and Matrix Formation of Mesenchymal Stem Cell and Anterior Cruciate Ligament Fibroblast. Stem Cells International. 2016, 9842075 (2016).
- Lin, X., Shi, Y., Cao, Y., Liu, W. Recent progress in stem cell differentiation directed by material and mechanical cues. Biomedical Materials. 11 (1), 014109 (2016).
- Li, R., et al. Mechanical strain regulates osteogenic and adipogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells. Biomed Research International. 2015, 873251 (2015).
- Zhang, J., Wang, J. H. C. Characterization of differential properties of rabbit tendon stem cells and tenocytes. BMC Musculoskeletal Disorders. 11, 10-10 (2010).
- Liu, X., Chen, W., Zhou, Y., Tang, K., Zhang, J. Mechanical Tension Promotes the Osteogenic Differentiation of Rat Tendon-derived Stem Cells Through the Wnt5a/Wnt5b/JNK Signaling Pathway. Cellular Physiology and Biochemistry. 36 (2), 517-530 (2015).
- Wang, T., et al. 3D uniaxial mechanical stimulation induces tenogenic differentiation of tendon-derived stem cells through a PI3K/AKT signaling pathway. FASEB Journal. 32 (9), 4804-4814 (2018).
- Calve, S., et al. Engineering of functional tendon. Tissue Engineering. 10 (5-6), 755-761 (2004).
- Kostrominova, T. Y., Calve, S., Arruda, E. M., Larkin, L. M. Ultrastructure of myotendinous junctions in tendon-skeletal muscle constructs engineered in vitro. Histology & Histopathology. 24 (5), 541-550 (2009).
- Wagner, J. R., Taguchi, T., Cho, J. Y., Charavaryamath, C., Griffon, D. J. Evaluation of Stem Cell Therapies in a Bilateral Patellar Tendon Injury Model in Rats. Journal of Visualized Experiments. (133), e56810 (2018).
- Kurtaliaj, I., Golman, M., Abraham, A. C., Thomopoulos, S. Biomechanical Testing of Murine Tendons. Journal of Visualized Experiments. (152), e60280 (2019).
- Hsiao, M. Y., et al. The Effect of the Repression of Oxidative Stress on Tenocyte Differentiation: A Preliminary Study of a Rat Cell Model Using a Novel Differential Tensile Strain Bioreactor. International Journal of Molecular Sciences. 20 (14), (2019).
- Morita, Y., et al. The optimal mechanical condition in stem cell-to-tenocyte differentiation determined with the homogeneous strain distributions and the cellular orientation control. Biology Open. 8 (5), 0339164 (2019).
- Shukunami, C., Oshima, Y., Hiraki, Y. Molecular cloning of tenomodulin, a novel chondromodulin-I related gene. Biochemical and Biophysical Research Communications. 280 (5), 1323-1327 (2001).
- Murchison, N. D., et al. Regulation of tendon differentiation by scleraxis distinguishes force-transmitting tendons from muscle-anchoring tendons. Development. 134 (14), 2697-2708 (2007).
- Liu, W., et al. The atypical homeodomain transcription factor Mohawk controls tendon morphogenesis. Molecular and Cellular Biology. 30 (20), 4797-4807 (2010).
- Chang, J., Thunder, R., Most, D., Longaker, M. T., Lineaweaver, W. C. Studies in flexor tendon wound healing: neutralizing antibody to TGF-beta1 increases postoperative range of motion. Plastic and Reconstructive Surgery. 105 (1), 148-155 (2000).
- Bennett, N. T., Schultz, G. S. Growth factors and wound healing: biochemical properties of growth factors and their receptors. American Journal of Surgery. 165 (6), 728-737 (1993).
- Wòjciak, B., Crossan, J. F. The effects of T cells and their products on in vitro healing of epitenon cell microwounds. Immunology. 83 (1), 93-98 (1994).
- Marui, T., et al. Effect of growth factors on matrix synthesis by ligament fibroblasts. Journal of Orthopaedic Research. 15 (1), 18-23 (1997).
- Ni, M., et al. Engineered scaffold-free tendon tissue produced by tendon-derived stem cells. Biomaterials. 34 (8), 2024-2037 (2013).
- Trumbull, A., Subramanian, G., Yildirim-Ayan, E. Mechanoresponsive musculoskeletal tissue differentiation of adipose-derived stem cells. Biomedical Engineering Online. 15, 43 (2016).
- Wang, T., et al. Programmable mechanical stimulation influences tendon homeostasis in a bioreactor system. Biotechnology and Bioengineering. 110 (5), 1495-1507 (2013).
- Nirmalanandhan, V. S., et al. Effect of scaffold material, construct length and mechanical stimulation on the in vitro stiffness of the engineered tendon construct. Journal of Biomechanics. 41 (4), 822-828 (2008).
- Doroski, D. M., Levenston, M. E., Temenoff, J. S. Cyclic tensile culture promotes fibroblastic differentiation of marrow stromal cells encapsulated in poly(ethylene glycol)-based hydrogels. Tissue Engineeringineering. Part A. 16 (11), 3457-3466 (2010).
- Altman, G. H., et al. Advanced bioreactor with controlled application of multi-dimensional strain for Tissue Engineeringineering. Journal of Biomechanical Engineering. 124 (6), 742-749 (2002).
- Webb, K., et al. Cyclic strain increases fibroblast proliferation, matrix accumulation, and elastic modulus of fibroblast-seeded polyurethane constructs. Journal of Biomechanics. 39 (6), 1136-1144 (2006).
- Parent, G., Huppé, N., Langelier, E. Low stress tendon fatigue is a relatively rapid process in the context of overuse injuries. Annals of Biomedical Engineering. 39 (5), 1535-1545 (2011).
- Wang, T., et al. Bioreactor design for tendon/ligament engineering. Tissue Engineeringineering. Part B, Reviews. 19 (2), 133-146 (2013).
- Smith, R. K. Mesenchymal stem cell therapy for equine tendinopathy. Disability and Rehabilitation. 30 (20-22), 1752-1758 (2008).
- Godwin, E. E., Young, N. J., Dudhia, J., Beamish, I. C., Smith, R. K. Implantation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells demonstrates improved outcome in horses with overstrain injury of the superficial digital flexor tendon. Journal of Equine Veterinary Science. 44 (1), 25-32 (2012).
- Lacitignola, L., Crovace, A., Rossi, G., Francioso, E. Cell therapy for tendinitis, experimental and clinical report. Veterinary Research Communications. 32, 33-38 (2008).
- Del Bue, M., et al. Equine adipose-tissue derived mesenchymal stem cells and platelet concentrates: their association in vitro and in vivo. Veterinary Research Communications. 32, 51-55 (2008).
- Awad, H. A., et al. Repair of patellar tendon injuries using a cell-collagen composite. Journal of Orthopaedic Research. 21 (3), 420-431 (2003).
