Anwendung eines dreidimensionalen uniaxialen mechanischen Stimulations-Bioreaktorsystems zur Induzieren tenogener Differenzierung von tendonabgeleiteten Stammzellen
Summary
Ein dreidimensionales uniaxiales mechanisches Stimulations-Bioreaktorsystem ist ein idealer Bioreaktor für tenogen-spezifische Differenzierung von Sehnenstammzellen und Neotendonbildung.
Abstract
Die Tendinopathie ist eine häufige chronische Sehnenerkrankung im Zusammenhang mit Entzündungen und Degeneration in einem orthopädischen Bereich. Mit hoher Morbidität, begrenzter Selbstreparaturkapazität und vor allem ohne definitive Behandlungen beeinflusst die Tendinopathie die Lebensqualität der Patienten immer noch negativ. Tendon-abgeleitete Stammzellen (TDSCs), als primäre Vorläuferzellen von Sehnenzellen, spielen eine wesentliche Rolle sowohl bei der Entwicklung der Teninopathie als auch bei der funktionellen und strukturellen Wiederherstellung nach der Tendinopathie. Daher wäre eine Methode nützlich, die in vitro die In-vivo-Differenzierung von TDSCs in Sehnenzellen imitieren kann. Hier beschreibt das vorliegende Protokoll eine Methode, die auf einem dreidimensionalen (3D) uniaxialen Dehnsystem basiert, um die TDSCs zu stimulieren, sich in sehnenartige Gewebe zu differenzieren. Es gibt sieben Stadien des vorliegenden Protokolls: Isolierung von Mäuse-TDSCs, Kultur und Ausdehnung von Mäuse-TDSCs, Vorbereitung von Stimulationskulturmedium für die Zellblattbildung, Zellblattbildung durch Kultivierung im Stimulationsmedium, Vorbereitung des 3D-Sehnenstammzellkonstrukts, Montage des uniaxial-dehnenden mechanischen Stimulationskomplexes und Auswertung des mechanisch stimulierten in vitro tendonähnlichen Gewebes. Die Wirksamkeit wurde durch histologische Gezeigt. Das gesamte Verfahren dauert weniger als 3 Wochen. Zur Förderung der extrazellulären Matrixabscheidung wurde 4,4 mg/ml Ascorbinsäure im Stimulationskulturmedium verwendet. Eine getrennte Kammer mit Linearmotor sorgt für eine genaue mechanische Beladung und ist tragbar und leicht einzustellen, was für den Bioreaktor gilt. Das Laderegime im vorliegenden Protokoll betrug 6% Dehnung, 0,25 Hz, 8 h, gefolgt von 16 h Ruhe für 6 Tage. Dieses Protokoll könnte die Zelldifferenzierung in der Sehne imitieren, was für die Untersuchung des pathologischen Prozesses der Teninopathie hilfreich ist. Darüber hinaus wird das sehnenähnliche Gewebe potenziell verwendet, um die Sehnenheilung bei Sehnenverletzungen als technisches autologes Transplantat zu fördern. Zusammenfassend ist das vorliegende Protokoll einfach, wirtschaftlich, reproduzierbar und gültig.
Introduction
Tendinopathie ist eine der häufigsten Sportverletzungen. Es manifestiert sich vor allem durch Schmerzen, lokale Schwellung, verminderte Muskelverspannungen im betroffenen Bereich, und Dysfunktion. Die Inzidenz von Teninopathie ist hoch. Das Vorhandensein von Achillessehnenopathie ist am häufigsten bei Mittel- und Langstreckenläufern (bis zu 29%), während das Vorhandensein von Patellar-Tendinopathie ist auch bei Athleten von Volleyball (45%), Basketball (32%), Leichtathletik (23%), Handball (15%) und Fußball (13%)1,2,3,4,5. Aufgrund der begrenzten Selbstheilungsfähigkeit der Sehne und des Mangels an wirksamen Behandlungen beeinflusst die Tendinopathie jedoch immer noch das Leben der Patienten negativ6,7. Darüber hinaus bleibt die Pathogenese der Tendinopathie unklar. Es gab viele Untersuchungen über seine Pathogenese, vor allem einschließlich “Entzündungstheorie”, “Degeneration Theorie”, “Überbeanspruchung Theorie”, und so weiter8. Derzeit glaubten viele Forscher, dass die Tendinopathie auf die fehlgeschlagene Selbstreparatur der Mikroverletzungen zurückzuführen ist, die durch übermäßige mechanische Belastung verursacht werden, die Sehnenerfahrungen9,10.
Tendon-abgeleitete Stammzellen (TDSCs), als primäre Vorläuferzellen von Sehnenzellen, spielen eine wesentliche Rolle sowohl bei der Entwicklung der Tendinopathie als auch bei der funktionellen und strukturellen Restauration nach der Tendinopathie11,12,13. Es wurde berichtet, dass mechanische Stressstimulation die Proliferation und Differenzierung von Osteozyten, Osteoblasten, glatten Muskelzellen, Fibroblasten, mesenchymalen Stammzellen und anderen kraftempfindlichen Zellen14,15,16,17,18verursachen könnte. Daher können TDSCs als eine der mechanosensitiven und multipotenten Zellen ähnlich stimuliert werden, um durch mechanische Belastung19,20zu differenzieren.
Unterschiedliche mechanische Belastungsparameter (Ladefestigkeit, Ladefrequenz, Ladeart und Ladezeit) können jedoch TDSCs dazu veranlassen, sich in verschiedene Zellen zu differenzieren21. Daher ist ein wirksames und gültiges mechanisches Belastungsregime für die Tenogenese von großer Bedeutung. Darüber hinaus gibt es verschiedene Arten von Bioreaktoren als Stimulationssysteme, die derzeit für die mechanische Beladung von TDSCs verwendet werden. Die Prinzipien jeder Art von Bioreaktor sind unterschiedlich, so dass auch die mechanischen Belastungsparameter, die verschiedenen Bioreaktoren entsprechen, unterschiedlich sind. Daher ist ein einfaches, wirtschaftliches und reproduzierbares Stimulationsprotokoll gefragt, einschließlich der Art des Bioreaktors, des entsprechenden Stimulationsmediums und des mechanischen Belastungsregimes.
Der vorliegende Artikel beschreibt eine Methode, die auf einem dreidimensionalen (3D) uniaxialen Dehnsystem basiert, um die TDSCs zu stimulieren, sich in sehnenartiges Gewebe zu differenzieren. Es gibt sieben Stadien des Protokolls: Isolierung von Mäuse-TDSCs, Kultur und Ausdehnung von Mäuse-TDSCs, Vorbereitung des Stimulationskulturmediums für die Zellblattbildung, Zellblattbildung durch Kultivierung im Stimulationsmedium, Vorbereitung des 3D-Sehnenstammzellkonstrukts, Montage des uniaxial-dehnenden mechanischen Stimulationskomplexes und Auswertung des mechanisch stimulierten in tendonähnlichen Gewebes. Das gesamte Verfahren dauert weniger als 3 Wochen, um das 3D-Zellkonstrukt zu erhalten, das weit kleiner ist als einige bestehende Methoden22,23. Das vorliegende Protokoll ist nachweislich in der Lage, TDSCs dazu zu bringen, sich in Sehnengewebe zu differenzieren, und es ist zuverlässiger als das derzeit häufig verwendete zweidimensionale (2D) Dehnsystem21. Die Wirksamkeit wurde durch histologische Gezeigt. Kurz gesagt, das vorliegende Protokoll ist einfach, wirtschaftlich, reproduzierbar und gültig.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Sehne ist ein mechanosensitives faseriges Bindegewebe. Früheren Untersuchungen zufolge könnte eine übermäßige mechanische Belastung zu einer osteogenen Differenzierung von Sehnenstammzellen führen, während eine unzureichende Belastung zu einer gestörten Kollagenfaserstruktur während der Sehnendifferenzierung führen würde21.
Eine allgemeine Ansicht ist, dass der Schlüssel zu einem idealen Bioreaktor die Fähigkeit ist, die in vitro zelluläre Mikroumgebun…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Forschung wurde durchgeführt, während der Autor “ein University of Western Australia International Fee Scholarship und einen University Postgraduate Award an der University of Western Australia” erhielt. Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (81802214) unterstützt.
Materials
| Ascorbic acid | Sigma-aldrich | PHR1008-2G | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibcoä by Life Technologies | 1908361 | |
| Histology processor | Leica | TP 1020 | |
| Minimal Essential Medium (Alpha-MEM) | Gibcoä by Life Technologies | 2003802 | |
| Mouse Tendon Derived Stem Cell | Isolated from Achilles tendons of 6- to 8-wk-old C57BL/6 mice. Then digested with type I collagenase (3 mg/ml; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) for 3 h and passed through a 70 mmcell strainer to yield single-cell suspensions. | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-aldrich | 441244 | |
| Streptomycin and penicillin mixture | Gibcoä by Life Technologies | 15140122 | |
| Three-dimensional Uniaxial Mechanical Stimulation Bioreactor System | Centre of Orthopaedic Translational Research, Medical School, University of Western Australia | Available from the corresponding author upon request. Or make it according to our design* *Wang T, Lin Z, Day RE, et al. Programmable mechanical stimulation influences tendon homeostasis in a bioreactor system. Biotechnol Bioeng. 2013;110(5):1495–1507. doi:10.1002/bit.24809 | |
| Trypsin | Gibcoä by Life Technologies | 1858331 |
Referências
- Knobloch, K., Yoon, U., Vogt, P. M. Acute and overuse injuries correlated to hours of training in master running athletes. Foot & Ankle International. 29 (7), 671-676 (2008).
- Kujala, U. M., Sarna, S., Kaprio, J. Cumulative incidence of achilles tendon rupture and tendinopathy in male former elite athletes. Clinical Journal of Sport Medicine. 15 (3), 133-135 (2005).
- Lian, O. B., Engebretsen, L., Bahr, R. Prevalence of jumper’s knee among elite athletes from different sports: a cross-sectional study. The American Journal of Sports Medicine. 33 (4), 561-567 (2005).
- Zwerver, J., Bredeweg, S. W., vanden Akker-Scheek, I. Prevalence of Jumper’s knee among nonelite athletes from different sports: a cross-sectional survey. The American Journal of Sports Medicine. 39 (9), 1984-1988 (2011).
- van der Worp, H., et al. Risk factors for patellar tendinopathy: a systematic review of the literature. British Journal of Sports Medicine. 45 (5), 446-452 (2011).
- Lopez, R. G. L., Jung, H. -. G. Achilles tendinosis: treatment options. Clinics in Orthopedic Surgery. 7 (1), 1-7 (2015).
- Wren, T. A., Yerby, S. A., Beaupré, G. S., Carter, D. R. Mechanical properties of the human achilles tendon. Clinical Biomechanics. 16 (3), 245-251 (2001).
- Rees, J. D., Wilson, A. M., Wolman, R. L. Current concepts in the management of tendon disorders. Rheumatology. 45 (5), 508-521 (2006).
- Magnan, B., Bondi, M., Pierantoni, S., Samaila, E. The pathogenesis of Achilles tendinopathy: a systematic review. Foot and Ankle Surgery. 20 (3), 154-159 (2014).
- Riley, G. The pathogenesis of tendinopathy. A molecular perspective. Rheumatology. 43 (2), 131-142 (2004).
- Bi, Y., et al. Identification of tendon stem/progenitor cells and the role of the extracellular matrix in their niche. Nature Medicine. 13 (10), 1219-1227 (2007).
- Zhang, J., Wang, J. H. C. BMP-2 mediates PGE(2) -induced reduction of proliferation and osteogenic differentiation of human tendon stem cells. Journal of Orthopaedic Research. 30 (2), 47-52 (2012).
- Chen, L., et al. Synergy of tendon stem cells and platelet-rich plasma in tendon healing. Journal of Orthopaedic Research. 30 (6), 991-997 (2012).
- Wang, J., et al. Mechanical stimulation orchestrates the osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells by regulating HDAC1. Cell Death & Disease. 7 (5), 2221 (2016).
- Parvizi, M., Bolhuis-Versteeg, L. A. M., Poot, A. A., Harmsen, M. C. Efficient generation of smooth muscle cells from adipose-derived stromal cells by 3D mechanical stimulation can substitute the use of growth factors in vascular Tissue Engineeringineering. Biotechnology Journal. 11 (7), 932-944 (2016).
- Sun, L., et al. Effects of Mechanical Stretch on Cell Proliferation and Matrix Formation of Mesenchymal Stem Cell and Anterior Cruciate Ligament Fibroblast. Stem Cells International. 2016, 9842075 (2016).
- Lin, X., Shi, Y., Cao, Y., Liu, W. Recent progress in stem cell differentiation directed by material and mechanical cues. Biomedical Materials. 11 (1), 014109 (2016).
- Li, R., et al. Mechanical strain regulates osteogenic and adipogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells. Biomed Research International. 2015, 873251 (2015).
- Zhang, J., Wang, J. H. C. Characterization of differential properties of rabbit tendon stem cells and tenocytes. BMC Musculoskeletal Disorders. 11, 10-10 (2010).
- Liu, X., Chen, W., Zhou, Y., Tang, K., Zhang, J. Mechanical Tension Promotes the Osteogenic Differentiation of Rat Tendon-derived Stem Cells Through the Wnt5a/Wnt5b/JNK Signaling Pathway. Cellular Physiology and Biochemistry. 36 (2), 517-530 (2015).
- Wang, T., et al. 3D uniaxial mechanical stimulation induces tenogenic differentiation of tendon-derived stem cells through a PI3K/AKT signaling pathway. FASEB Journal. 32 (9), 4804-4814 (2018).
- Calve, S., et al. Engineering of functional tendon. Tissue Engineering. 10 (5-6), 755-761 (2004).
- Kostrominova, T. Y., Calve, S., Arruda, E. M., Larkin, L. M. Ultrastructure of myotendinous junctions in tendon-skeletal muscle constructs engineered in vitro. Histology & Histopathology. 24 (5), 541-550 (2009).
- Wagner, J. R., Taguchi, T., Cho, J. Y., Charavaryamath, C., Griffon, D. J. Evaluation of Stem Cell Therapies in a Bilateral Patellar Tendon Injury Model in Rats. Journal of Visualized Experiments. (133), e56810 (2018).
- Kurtaliaj, I., Golman, M., Abraham, A. C., Thomopoulos, S. Biomechanical Testing of Murine Tendons. Journal of Visualized Experiments. (152), e60280 (2019).
- Hsiao, M. Y., et al. The Effect of the Repression of Oxidative Stress on Tenocyte Differentiation: A Preliminary Study of a Rat Cell Model Using a Novel Differential Tensile Strain Bioreactor. International Journal of Molecular Sciences. 20 (14), (2019).
- Morita, Y., et al. The optimal mechanical condition in stem cell-to-tenocyte differentiation determined with the homogeneous strain distributions and the cellular orientation control. Biology Open. 8 (5), 0339164 (2019).
- Shukunami, C., Oshima, Y., Hiraki, Y. Molecular cloning of tenomodulin, a novel chondromodulin-I related gene. Biochemical and Biophysical Research Communications. 280 (5), 1323-1327 (2001).
- Murchison, N. D., et al. Regulation of tendon differentiation by scleraxis distinguishes force-transmitting tendons from muscle-anchoring tendons. Development. 134 (14), 2697-2708 (2007).
- Liu, W., et al. The atypical homeodomain transcription factor Mohawk controls tendon morphogenesis. Molecular and Cellular Biology. 30 (20), 4797-4807 (2010).
- Chang, J., Thunder, R., Most, D., Longaker, M. T., Lineaweaver, W. C. Studies in flexor tendon wound healing: neutralizing antibody to TGF-beta1 increases postoperative range of motion. Plastic and Reconstructive Surgery. 105 (1), 148-155 (2000).
- Bennett, N. T., Schultz, G. S. Growth factors and wound healing: biochemical properties of growth factors and their receptors. American Journal of Surgery. 165 (6), 728-737 (1993).
- Wòjciak, B., Crossan, J. F. The effects of T cells and their products on in vitro healing of epitenon cell microwounds. Immunology. 83 (1), 93-98 (1994).
- Marui, T., et al. Effect of growth factors on matrix synthesis by ligament fibroblasts. Journal of Orthopaedic Research. 15 (1), 18-23 (1997).
- Ni, M., et al. Engineered scaffold-free tendon tissue produced by tendon-derived stem cells. Biomaterials. 34 (8), 2024-2037 (2013).
- Trumbull, A., Subramanian, G., Yildirim-Ayan, E. Mechanoresponsive musculoskeletal tissue differentiation of adipose-derived stem cells. Biomedical Engineering Online. 15, 43 (2016).
- Wang, T., et al. Programmable mechanical stimulation influences tendon homeostasis in a bioreactor system. Biotechnology and Bioengineering. 110 (5), 1495-1507 (2013).
- Nirmalanandhan, V. S., et al. Effect of scaffold material, construct length and mechanical stimulation on the in vitro stiffness of the engineered tendon construct. Journal of Biomechanics. 41 (4), 822-828 (2008).
- Doroski, D. M., Levenston, M. E., Temenoff, J. S. Cyclic tensile culture promotes fibroblastic differentiation of marrow stromal cells encapsulated in poly(ethylene glycol)-based hydrogels. Tissue Engineeringineering. Part A. 16 (11), 3457-3466 (2010).
- Altman, G. H., et al. Advanced bioreactor with controlled application of multi-dimensional strain for Tissue Engineeringineering. Journal of Biomechanical Engineering. 124 (6), 742-749 (2002).
- Webb, K., et al. Cyclic strain increases fibroblast proliferation, matrix accumulation, and elastic modulus of fibroblast-seeded polyurethane constructs. Journal of Biomechanics. 39 (6), 1136-1144 (2006).
- Parent, G., Huppé, N., Langelier, E. Low stress tendon fatigue is a relatively rapid process in the context of overuse injuries. Annals of Biomedical Engineering. 39 (5), 1535-1545 (2011).
- Wang, T., et al. Bioreactor design for tendon/ligament engineering. Tissue Engineeringineering. Part B, Reviews. 19 (2), 133-146 (2013).
- Smith, R. K. Mesenchymal stem cell therapy for equine tendinopathy. Disability and Rehabilitation. 30 (20-22), 1752-1758 (2008).
- Godwin, E. E., Young, N. J., Dudhia, J., Beamish, I. C., Smith, R. K. Implantation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells demonstrates improved outcome in horses with overstrain injury of the superficial digital flexor tendon. Journal of Equine Veterinary Science. 44 (1), 25-32 (2012).
- Lacitignola, L., Crovace, A., Rossi, G., Francioso, E. Cell therapy for tendinitis, experimental and clinical report. Veterinary Research Communications. 32, 33-38 (2008).
- Del Bue, M., et al. Equine adipose-tissue derived mesenchymal stem cells and platelet concentrates: their association in vitro and in vivo. Veterinary Research Communications. 32, 51-55 (2008).
- Awad, H. A., et al. Repair of patellar tendon injuries using a cell-collagen composite. Journal of Orthopaedic Research. 21 (3), 420-431 (2003).
