JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicina

تطبيق نظام حفّال ميكانيكي أحادي الأبعاد أحادي الأبعاد للتحفيز الحيوي للحث على التمايز التنوجيني للخلايا الجذعية المشتقة من الأوتار

Published: August 01, 2020
doi:
10.3791/61278
, , , , , , ,
1Centre of Orthopaedic Translational Research, Medical School,University of Western Australia

Summary

نظام ثلاثي الأبعاد للتحفيز الميكانيكي أحادي الأبعاد هو مفاعل حيوي مثالي للتمايز التنغيم الخاص بالخلايا الجذعية المشتقة من الأوتار وتكوين الأوتار الجديد.

Abstract

اعتلال التناد هو مرض شائع من أمراض الوتر المزمن المتعلقة بالالتهاب والانحطاط في منطقة تقويم العظام. مع ارتفاع معدلات المراضة، والقدرة على إصلاح الذات محدودة، والأهم من ذلك، لا علاجات نهائية، اعتلال الأوتار لا يزال يؤثر على نوعية حياة المرضى سلبا. الخلايا الجذعية المشتقة من الأوتار (TDSCs) ، كخلايا أولية أولية من خلايا الأوتار ، تلعب دورًا أساسيًا في تطور اعتلال الأوتار ، والاستعادة الوظيفية والهيكلية بعد اعتلال الأوتار. وهكذا، فإن الطريقة التي يمكن في المختبر تقليد التمايز في الجسم الحي من TDSCs في خلايا الأوتار سيكون من المفيد. هنا، يصف هذا البروتوكول طريقة تستند إلى نظام تمدد أحادي الأبعاد ثلاثي الأبعاد (3D) لتحفيز TDSCs على التفريق في أنسجة تشبه الأوتار. هناك سبع مراحل من البروتوكول الحالي: عزل ماوس TDSCs, ثقافة وتوسع فئران TDSCs, إعداد الحفز ثقافة المتوسطة لتشكيل ورقة الخلية, تشكيل ورقة الخلية عن طريق زراعة في التحفيز المتوسطة, إعداد 3D وتر الخلايا الجذعية بناء, تجميع مجمع التحفيز الميكانيكية أحادية التمدد, وتقييم الميكانيكية حفز في النسيج مثل وتر فيترو. وقد أثبتت الأنسجة فعالية. تستغرق العملية بأكملها أقل من 3 أسابيع. لتعزيز ترسب المصفوفة خارج الخلية، تم استخدام 4.4 ملغ/مل حمض الاسكوربيك في المحفزات المتوسطة الثقافة. غرفة منفصلة مع محرك خطي يوفر دقة التحميل الميكانيكية وقابل للنقل وتعديلها بسهولة، والتي يتم تطبيقها على مفاعل حيوي. وكان نظام التحميل في هذا البروتوكول 6٪ سلالة، 0.25 هرتز، 8 ساعة، تليها 16 ساعة من الراحة لمدة 6 أيام. يمكن أن يحاكي هذا البروتوكول تمايز الخلايا في الوتر ، وهو مفيد للتحقيق في العملية المرضية لاعتلال الوتر. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تستخدم الأنسجة الشبيهة بالوتر لتعزيز شفاء الأوتار في إصابة الأوتار ككسب غير مشروع ذاتي هندسي. وخلاصة القول إن هذا البروتوكول بسيط واقتصادي ويمكن استنساخه وصحته.

Introduction

اعتلال التتناد هو واحد من الإصابات الرياضية الشائعة. ويتجلى ذلك أساسا من الألم, تورم المحلية, انخفاض التوتر العضلي في المنطقة المصابة, والخلل الوظيفي. الإصابة باعتلال الوتار عالية. وجود اعتلال الأوتار أخيل هو الأكثر شيوعا للعدائين المسافات المتوسطة والطويلة (تصل إلى 29٪)، في حين أن وجود اعتلال الأوتار الرضفة أيضا عالية في الرياضيين من الكرة الطائرة (45٪)، وكرة السلة (32٪)، والمضمار والميدان (23٪)، وكرة اليد (15٪)، وكرة القدم (13٪)1،,2،,3،,4،,5. ومع ذلك ، بسبب قدرة محدودة على الشفاء الذاتي من وتر ، وعدم وجود علاجات فعالة ، والاعتلال لا يزال يؤثر على حياة المرضى سلبا6،7. وعلاوة على ذلك، لا يزال من غير الواضح التسبب في اعتلال التناد. كانت هناك العديد من التحقيقات حول مسببات المرض ، بما في ذلك أساسا “نظرية الالتهاب” ، “نظرية الانحطاط” ، “نظرية الإفراط في الاستخدام” ، وهكذا4. في الوقت الحاضر، يعتقد العديد من الباحثين أن اعتلال الأوتار كان بسبب فشل الإصلاح الذاتي للإصابات الدقيقة الناجمة عن التحميل الميكانيكي المفرط لتجارب وتر9،10.

الخلايا الجذعية المشتقة من الأوتار (TDSCs) ، كخلايا أولية لخلايا الأوتار ، تلعب دورًا أساسيًا في تطوير اعتلال الأوتار والاستعادة الوظيفية والهيكلية بعد اعتلال الأوتار11،12،13. وأفيد أن التحفيز العصبي الميكانيكي يمكن أن يسبب انتشار وتمايز osteocytes، والعظام، والخلايا العضلية الملساء، الخلايا الليفية، والخلايا الجذعية mesenchymal وغيرها من الخلايا الحساسة للقوة14،15،16،17،18. ولذلك، TDSCs، باعتبارها واحدة من الخلايا الحساسية ومتعددة القدرات، ويمكن أيضا أن يكون حافزا للتمييز عن طريق تحميل الميكانيكية19،20.

ومع ذلك، يمكن أن المعلمات تحميل الميكانيكية المختلفة (قوة التحميل، تردد التحميل، نوع التحميل وفترة التحميل) يمكن أن تحفز TDSCs للتمييز في خلايا مختلفة21. وبالتالي ، فإن نظام التحميل الميكانيكية الفعالة والصالحة مهم جدًا بالنسبة لـ tenogenesis. وعلاوة على ذلك، هناك أنواع مختلفة من المفاعلات الحيوية كأنظمة تحفيز تستخدم حالياً لتوفير التحميل الميكانيكي للبلدان النامية. مبادئ كل نوع من مفاعلات الحيوية مختلفة ، وبالتالي فإن المعلمات التحميل الميكانيكية المقابلة لمختلف المفاعلات الحيوية هي أيضا مختلفة. ولذلك، فإن بروتوكول التحفيز البسيط والاقتصادي والقابل للاستنساخ مطلوب، بما في ذلك نوع مفاعل حيوي، ووسيلة التحفيز المقابلة، ونظام التحميل الميكانيكي.

وتصف هذه المقالة طريقة تستند إلى نظام تمدد أحادي الأبعاد ثلاثي الأبعاد (3D) لتحفيز TDSCs على التفريق في أنسجة تشبه الأوتار. هناك سبع مراحل من البروتوكول: عزل TDSCs الفئران، والثقافة والتوسع في الفئران TDSCs، وإعداد ثقافة التحفيز المتوسطة لتشكيل ورقة الخلية، وتشكيل ورقة الخلية عن طريق زراعة في التحفيز المتوسط، وإعداد 3D وتر الخلايا الجذعية بناء، وتجميع مجمع التحفيز الميكانيكية أحادية التمدد، وتقييم الميكانيكية حفز في الأنسجة مثل وتر فيترو. الإجراء كله يستغرق أقل من 3 أسابيع للحصول على بناء الخلية 3D، وهو أقل بكثير من بعض الأساليب القائمة22،23. وقد ثبت أن البروتوكول الحالي قادر على حث TDSCs على التفريق في أنسجة الأوتار ، وهو أكثر موثوقية من نظام التمدد ثنائي الأبعاد (2D) الحالي الشائع الاستخدام (2D). وقد أثبتت الأنسجة فعالية. وباختصار، فإن هذا البروتوكول بسيط واقتصادي ويمكن استنساخه وصحته.

Protocol

وقد تمت الموافقة على الأساليب الموصوفة وتنفيذها وفقاً للمبادئ التوجيهية واللوائح الصادرة عن لجنة أخلاقيات الحيوان بجامعة غرب أستراليا. 1- عزل الفئران TDSCs القتل الرحيم 6-8 أسابيع من العمر C57BL/6 الفئران عن طريق خلع عنق الرحم. حصاد الأوتار الرضفة24 وأوتار ?…

Representative Results

قبل التحفيز الميكانيكي، نمت TDSCs إلى التقاء 100٪ في المتوسط الكامل وعرض مورفولوجيا فائقة التنظيم غير منظم(الشكل 2A). بعد 6 أيام من التحميل الميكانيكية تمتد uniaxial، مصفوفة خارج الخلية (ECM) ومحاذاة الخلية كانت موجهة بشكل جيد (الشكل 2B). كانت الخلايا مأهولة بشكل جيد ومغلفة بشكل جيد ف…

Discussion

وتر هو نسيج الضام الليفي الليفي النياني. وفقا للبحوث السابقة، التحميل الميكانيكية الزائدة يمكن أن تؤدي إلى تمايز العظم من الخلايا الجذعية وتر، في حين أن التحميل غير كافية من شأنه أن يؤدي إلى اضطراب هيكل الألياف الكولاجين خلال التمايز وتر21.

وهناك رأي شائع هو أن …

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وقد أجري البحث بينما كان صاحب البلاغ يحصل على “منحة دراسية من جامعة غرب أستراليا للحصول على رسوم دولية وجائزة للدراسات العليا الجامعية في جامعة غرب أستراليا”. وقد دعم هذا العمل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية الصينية (81802214).

Materials

Ascorbic acid Sigma-aldrich PHR1008-2G
Fetal bovine serum (FBS) Gibcoä by Life Technologies 1908361
Histology processor Leica TP 1020
Minimal Essential Medium (Alpha-MEM) Gibcoä by Life Technologies 2003802
Mouse Tendon Derived Stem Cell Isolated from Achilles tendons of 6- to 8-wk-old C57BL/6 mice. Then digested with type I collagenase (3 mg/ml; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) for 3 h and passed through a 70 mmcell strainer to yield single-cell suspensions.
Paraformaldehyde Sigma-aldrich 441244
Streptomycin and penicillin mixture Gibcoä by Life Technologies 15140122
Three-dimensional Uniaxial Mechanical Stimulation Bioreactor System Centre of Orthopaedic Translational Research, Medical School, University of Western Australia Available from the corresponding author upon request. Or make it according to our design* *Wang T, Lin Z, Day RE, et al. Programmable mechanical stimulation influences tendon homeostasis in a bioreactor system. Biotechnol Bioeng. 2013;110(5):1495–1507. doi:10.1002/bit.24809
Trypsin Gibcoä by Life Technologies 1858331
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Knobloch, K., Yoon, U., Vogt, P. M. Acute and overuse injuries correlated to hours of training in master running athletes. Foot & Ankle International. 29 (7), 671-676 (2008).
  2. Kujala, U. M., Sarna, S., Kaprio, J. Cumulative incidence of achilles tendon rupture and tendinopathy in male former elite athletes. Clinical Journal of Sport Medicine. 15 (3), 133-135 (2005).
  3. Lian, O. B., Engebretsen, L., Bahr, R. Prevalence of jumper’s knee among elite athletes from different sports: a cross-sectional study. The American Journal of Sports Medicine. 33 (4), 561-567 (2005).
  4. Zwerver, J., Bredeweg, S. W., vanden Akker-Scheek, I. Prevalence of Jumper’s knee among nonelite athletes from different sports: a cross-sectional survey. The American Journal of Sports Medicine. 39 (9), 1984-1988 (2011).
  5. van der Worp, H., et al. Risk factors for patellar tendinopathy: a systematic review of the literature. British Journal of Sports Medicine. 45 (5), 446-452 (2011).
  6. Lopez, R. G. L., Jung, H. -. G. Achilles tendinosis: treatment options. Clinics in Orthopedic Surgery. 7 (1), 1-7 (2015).
  7. Wren, T. A., Yerby, S. A., Beaupré, G. S., Carter, D. R. Mechanical properties of the human achilles tendon. Clinical Biomechanics. 16 (3), 245-251 (2001).
  8. Rees, J. D., Wilson, A. M., Wolman, R. L. Current concepts in the management of tendon disorders. Rheumatology. 45 (5), 508-521 (2006).
  9. Magnan, B., Bondi, M., Pierantoni, S., Samaila, E. The pathogenesis of Achilles tendinopathy: a systematic review. Foot and Ankle Surgery. 20 (3), 154-159 (2014).
  10. Riley, G. The pathogenesis of tendinopathy. A molecular perspective. Rheumatology. 43 (2), 131-142 (2004).
  11. Bi, Y., et al. Identification of tendon stem/progenitor cells and the role of the extracellular matrix in their niche. Nature Medicine. 13 (10), 1219-1227 (2007).
  12. Zhang, J., Wang, J. H. C. BMP-2 mediates PGE(2) -induced reduction of proliferation and osteogenic differentiation of human tendon stem cells. Journal of Orthopaedic Research. 30 (2), 47-52 (2012).
  13. Chen, L., et al. Synergy of tendon stem cells and platelet-rich plasma in tendon healing. Journal of Orthopaedic Research. 30 (6), 991-997 (2012).
  14. Wang, J., et al. Mechanical stimulation orchestrates the osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells by regulating HDAC1. Cell Death & Disease. 7 (5), 2221 (2016).
  15. Parvizi, M., Bolhuis-Versteeg, L. A. M., Poot, A. A., Harmsen, M. C. Efficient generation of smooth muscle cells from adipose-derived stromal cells by 3D mechanical stimulation can substitute the use of growth factors in vascular Tissue Engineeringineering. Biotechnology Journal. 11 (7), 932-944 (2016).
  16. Sun, L., et al. Effects of Mechanical Stretch on Cell Proliferation and Matrix Formation of Mesenchymal Stem Cell and Anterior Cruciate Ligament Fibroblast. Stem Cells International. 2016, 9842075 (2016).
  17. Lin, X., Shi, Y., Cao, Y., Liu, W. Recent progress in stem cell differentiation directed by material and mechanical cues. Biomedical Materials. 11 (1), 014109 (2016).
  18. Li, R., et al. Mechanical strain regulates osteogenic and adipogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells. Biomed Research International. 2015, 873251 (2015).
  19. Zhang, J., Wang, J. H. C. Characterization of differential properties of rabbit tendon stem cells and tenocytes. BMC Musculoskeletal Disorders. 11, 10-10 (2010).
  20. Liu, X., Chen, W., Zhou, Y., Tang, K., Zhang, J. Mechanical Tension Promotes the Osteogenic Differentiation of Rat Tendon-derived Stem Cells Through the Wnt5a/Wnt5b/JNK Signaling Pathway. Cellular Physiology and Biochemistry. 36 (2), 517-530 (2015).
  21. Wang, T., et al. 3D uniaxial mechanical stimulation induces tenogenic differentiation of tendon-derived stem cells through a PI3K/AKT signaling pathway. FASEB Journal. 32 (9), 4804-4814 (2018).
  22. Calve, S., et al. Engineering of functional tendon. Tissue Engineering. 10 (5-6), 755-761 (2004).
  23. Kostrominova, T. Y., Calve, S., Arruda, E. M., Larkin, L. M. Ultrastructure of myotendinous junctions in tendon-skeletal muscle constructs engineered in vitro. Histology & Histopathology. 24 (5), 541-550 (2009).
  24. Wagner, J. R., Taguchi, T., Cho, J. Y., Charavaryamath, C., Griffon, D. J. Evaluation of Stem Cell Therapies in a Bilateral Patellar Tendon Injury Model in Rats. Journal of Visualized Experiments. (133), e56810 (2018).
  25. Kurtaliaj, I., Golman, M., Abraham, A. C., Thomopoulos, S. Biomechanical Testing of Murine Tendons. Journal of Visualized Experiments. (152), e60280 (2019).
  26. Hsiao, M. Y., et al. The Effect of the Repression of Oxidative Stress on Tenocyte Differentiation: A Preliminary Study of a Rat Cell Model Using a Novel Differential Tensile Strain Bioreactor. International Journal of Molecular Sciences. 20 (14), (2019).
  27. Morita, Y., et al. The optimal mechanical condition in stem cell-to-tenocyte differentiation determined with the homogeneous strain distributions and the cellular orientation control. Biology Open. 8 (5), 0339164 (2019).
  28. Shukunami, C., Oshima, Y., Hiraki, Y. Molecular cloning of tenomodulin, a novel chondromodulin-I related gene. Biochemical and Biophysical Research Communications. 280 (5), 1323-1327 (2001).
  29. Murchison, N. D., et al. Regulation of tendon differentiation by scleraxis distinguishes force-transmitting tendons from muscle-anchoring tendons. Development. 134 (14), 2697-2708 (2007).
  30. Liu, W., et al. The atypical homeodomain transcription factor Mohawk controls tendon morphogenesis. Molecular and Cellular Biology. 30 (20), 4797-4807 (2010).
  31. Chang, J., Thunder, R., Most, D., Longaker, M. T., Lineaweaver, W. C. Studies in flexor tendon wound healing: neutralizing antibody to TGF-beta1 increases postoperative range of motion. Plastic and Reconstructive Surgery. 105 (1), 148-155 (2000).
  32. Bennett, N. T., Schultz, G. S. Growth factors and wound healing: biochemical properties of growth factors and their receptors. American Journal of Surgery. 165 (6), 728-737 (1993).
  33. Wòjciak, B., Crossan, J. F. The effects of T cells and their products on in vitro healing of epitenon cell microwounds. Immunology. 83 (1), 93-98 (1994).
  34. Marui, T., et al. Effect of growth factors on matrix synthesis by ligament fibroblasts. Journal of Orthopaedic Research. 15 (1), 18-23 (1997).
  35. Ni, M., et al. Engineered scaffold-free tendon tissue produced by tendon-derived stem cells. Biomaterials. 34 (8), 2024-2037 (2013).
  36. Trumbull, A., Subramanian, G., Yildirim-Ayan, E. Mechanoresponsive musculoskeletal tissue differentiation of adipose-derived stem cells. Biomedical Engineering Online. 15, 43 (2016).
  37. Wang, T., et al. Programmable mechanical stimulation influences tendon homeostasis in a bioreactor system. Biotechnology and Bioengineering. 110 (5), 1495-1507 (2013).
  38. Nirmalanandhan, V. S., et al. Effect of scaffold material, construct length and mechanical stimulation on the in vitro stiffness of the engineered tendon construct. Journal of Biomechanics. 41 (4), 822-828 (2008).
  39. Doroski, D. M., Levenston, M. E., Temenoff, J. S. Cyclic tensile culture promotes fibroblastic differentiation of marrow stromal cells encapsulated in poly(ethylene glycol)-based hydrogels. Tissue Engineeringineering. Part A. 16 (11), 3457-3466 (2010).
  40. Altman, G. H., et al. Advanced bioreactor with controlled application of multi-dimensional strain for Tissue Engineeringineering. Journal of Biomechanical Engineering. 124 (6), 742-749 (2002).
  41. Webb, K., et al. Cyclic strain increases fibroblast proliferation, matrix accumulation, and elastic modulus of fibroblast-seeded polyurethane constructs. Journal of Biomechanics. 39 (6), 1136-1144 (2006).
  42. Parent, G., Huppé, N., Langelier, E. Low stress tendon fatigue is a relatively rapid process in the context of overuse injuries. Annals of Biomedical Engineering. 39 (5), 1535-1545 (2011).
  43. Wang, T., et al. Bioreactor design for tendon/ligament engineering. Tissue Engineeringineering. Part B, Reviews. 19 (2), 133-146 (2013).
  44. Smith, R. K. Mesenchymal stem cell therapy for equine tendinopathy. Disability and Rehabilitation. 30 (20-22), 1752-1758 (2008).
  45. Godwin, E. E., Young, N. J., Dudhia, J., Beamish, I. C., Smith, R. K. Implantation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells demonstrates improved outcome in horses with overstrain injury of the superficial digital flexor tendon. Journal of Equine Veterinary Science. 44 (1), 25-32 (2012).
  46. Lacitignola, L., Crovace, A., Rossi, G., Francioso, E. Cell therapy for tendinitis, experimental and clinical report. Veterinary Research Communications. 32, 33-38 (2008).
  47. Del Bue, M., et al. Equine adipose-tissue derived mesenchymal stem cells and platelet concentrates: their association in vitro and in vivo. Veterinary Research Communications. 32, 51-55 (2008).
  48. Awad, H. A., et al. Repair of patellar tendon injuries using a cell-collagen composite. Journal of Orthopaedic Research. 21 (3), 420-431 (2003).

Tags

Tendon-derived Stem CellsMechanical StimulationBioreactor SystemTenogenic DifferentiationTendinopathyCell Culture
check_url/pt/61278?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Chen, Z., Chen, P., Ruan, R., Chen, L., Yuan, J., Wood, D., Wang, T., Zheng, M. H. Applying a Three-dimensional Uniaxial Mechanical Stimulation Bioreactor System to Induce Tenogenic Differentiation of Tendon-Derived Stem Cells. J. Vis. Exp. (162), e61278, doi:10.3791/61278 (2020).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image