JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicina

Toepassing van een drie-dimensionale uniaxiale mechanische stimulatie bioreactor systeem om tenogene differentiatie van pees-afgeleide stamcellen induceren

Published: August 01, 2020
doi:
10.3791/61278
, , , , , , ,
1Centre of Orthopaedic Translational Research, Medical School,University of Western Australia

Summary

Een driedimensionaal uniaxiale mechanische stimulatie bioreactorsysteem is een ideale bioreactor voor tenogeen-specifieke differentiatie van pees-afgeleide stamcellen en neo-peesvorming.

Abstract

Tendinopathie is een veel voorkomende chronische peesziekte met betrekking tot ontsteking en degeneratie in een orthopedisch gebied. Met een hoge morbiditeit, beperkte zelfherstellende capaciteit en, belangrijker nog, geen definitieve behandelingen, tendinopathie nog steeds van invloed op de kwaliteit van het leven van patiënten negatief. Pees-afgeleide stamcellen (TDC’s), als primaire voorloper cellen van peescellen, spelen een essentiële rol in zowel de ontwikkeling van tendinopathie, en functionele en structurele restauratie na tendinopathie. Zo zou een methode die in vitro de in vivo differentiatie van TSCs in peescellen kan nabootsen nuttig zijn. Hier beschrijft het huidige protocol een methode op basis van een driedimensionaal (3D) uniaxial stretchingsysteem om de TSCs te stimuleren om zich te onderscheiden in peesachtige weefsels. Er zijn zeven stadia van het huidige protocol: isolatie van muizen-TSCs, cultuur en uitbreiding van muizen-TSCs, voorbereiding van stimulatiecultuurmedium voor celbladvorming, celbladvorming door culturing in stimulatiemedium, voorbereiding van 3D-peesstamcelconstructie, assemblage van het uniaxiale mechanische stimulatiecomplex en evaluatie van het mechanische gestimuleerde in vitropepeweefsel. De effectiviteit werd aangetoond door histologie. De hele procedure duurt minder dan 3 weken. Om extracellulaire matrixdepositie te bevorderen, werd 4,4 mg/mL ascorbinezuur gebruikt in het stimulatiecultuurmedium. Een gescheiden kamer met een lineaire motor zorgt voor nauwkeurige mechanische belasting en is draagbaar en gemakkelijk af te stellen, die wordt toegepast voor de bioreactor. Het laadregime in het huidige protocol was 6% spanning, 0,25 Hz, 8 uur, gevolgd door 16 uur rust gedurende 6 dagen. Dit protocol kan celdifferentiatie in de pees nabootsen, wat nuttig is voor het onderzoek van het pathologische proces van tendinopathie. Bovendien wordt het peesachtige weefsel mogelijk gebruikt om de genezing van pees bij peesletsel als een gemanipuleerde autologe graft te bevorderen. Kortom, het huidige protocol is eenvoudig, economisch, reproduceerbaar en geldig.

Introduction

Tendinopathie is een van de gemeenschappelijke sportblessures. Het manifesteert zich voornamelijk door pijn, lokale zwelling, verminderde spierspanning in het getroffen gebied, en disfunctie. De incidentie van tendinopathie is hoog. De aanwezigheid van achilles tendinopathie komt het meest voor bij midden- en langeafstandslopers (tot 29%), terwijl de aanwezigheid van patellar tendinopathie ook hoog is bij volleyballers (45%), basketbal (32%), atletiek (23%), handbal (15%), en voetbal (13%)1,2,3,4,5. Echter, als gevolg van de beperkte zelfhelende vermogen van de pees, en het gebrek aan effectieve behandelingen, tendinopathie nog steeds van invloed op het leven van patiënten negatief6,7. Bovendien blijft de pathogenese van tendinopathie onduidelijk. Er zijn veel onderzoeken geweest naar de pathogenese, voornamelijk met inbegrip van “ontstekingstheorie”, “degeneratietheorie”, “overmatig gebruikstheorie”, enzovoort8. Op dit moment, veel onderzoekers geloofden dat tendinopathie was te wijten aan de mislukte zelf-reparatie aan de micro-verwondingen veroorzaakt door overmatige mechanische belasting van de pees ervaringen9,10.

Tendon-afgeleide stamcellen (TSCs), als primaire voorloper cellen van peescellen, spelen een essentiële rol in zowel de ontwikkeling van tendinopathie en functionele en structurele restauratie na tendinopathie11,12,13. Er werd gemeld dat mechanische stressstimulatie de proliferatie en differentiatie van osteocyten, osteoblasten, gladde spiercellen, fibroblasten, mesenchymale stamcellen en andere krachtgevoelige cellen14,15,16,17,18kan veroorzaken . Daarom kunnen TSC’s, als een van de mechanosensitive en multipotent cellen , eveneens worden gestimuleerd om te differentiëren door mechanische belasting19,20.

Verschillende mechanische belastingparameters (laadsterkte, laadfrequentie, laadtype en laadperiode) kunnen tdsc’s er echter toe aanzetten zich te onderscheiden in verschillende cellen21. Een effectief en geldig mechanisch belastingregime is dus zeer belangrijk voor tenogenese. Bovendien zijn er verschillende soorten bioreactoren als stimulatiesystemen die momenteel worden gebruikt voor het leveren van mechanische belasting aan TSC’s. De principes van elk soort bioreactor zijn verschillend, zodat zijn de mechanische ladingsparameters die aan verschillende bioreactoren overeenkomen ook verschillend. Daarom is er een eenvoudig, economisch en reproduceerbaar stimulatieprotocol in trek, inclusief het type bioreactor, het bijbehorende stimulatiemedium en het mechanische belastingregime.

Het onderhavige artikel beschrijft een methode op basis van een driedimensionaal (3D) uniaxial stretching systeem om de TSCs te stimuleren om zich te onderscheiden in peesachtig weefsel. Er zijn zeven stadia van het protocol: isolatie van muizen-TSCs, cultuur en uitbreiding van muizen-TSCs, voorbereiding van stimulatiecultuurmedium voor celbladvorming, celbladvorming door te kweken in stimulatiemedium, voorbereiding van 3D-peesstamcelconstructie, assemblage van het uniaxiale mechanische stimulatiecomplex en evaluatie van het mechanische gestimuleerde in vitrodonpees-achtige weefsel. De hele procedure duurt minder dan 3 weken om de 3D-celconstructie te verkrijgen, wat veel minder is dan sommige bestaande methoden22,23. Het huidige protocol is bewezen te kunnen tdc’s te onderscheiden in peesweefsel, en het is betrouwbaarder dan de huidige veelgebruikte tweedimensionale (2D) stretching systeem21. De effectiviteit werd aangetoond door histologie. Kortom, het huidige protocol is eenvoudig, economisch, reproduceerbaar en geldig.

Protocol

De beschreven methoden werden goedgekeurd en uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften van de University of Western Australia Animal Ethics Committee. 1. Isolatie van muizen-TDC’s Euthanaseer de 6-8 weken oude C57BL/6 muizen door cervicale dislocatie. Oogst patellar pezen24 en achillespezen25. Verteren pezen van een met 6 mL van het type I collagenase (3 mg/mL) voor 3 uur.OPMERKING: Aangez…

Representative Results

Vóór mechanische stimulatie werden TSC’s tot 100% samenvloeiing in compleet medium en vertoonden ze een ongeorganiseerde ultrastructurele morfologie(figuur 2A). Na 6 dagen van uniaxiale stretching mechanische belasting, extracellulaire matrix (ECM) en cel uitlijningen waren goed georiënteerd (Figuur 2B). Cellen waren goed bevolkt en goed gehuld in ECM na mechanische belasting. Celmorfologie werd gepresenteerd om langwerpig te zijn en leek meer op normale peescel in vergelijking met di…

Discussion

De pees is een mechanosensitive vezelig bindweefsel. Volgens eerder onderzoek kan overtollige mechanische belasting leiden tot osteogene differentiatie van peesstamcellen, terwijl onvoldoende belasting zou leiden tot een verstoorde collageenvezelstructuur tijdens peesdifferentiatie21.

Een gemeenschappelijke mening is dat de sleutel tot een ideale bioreactor de capaciteit is om de in vitro cellulaire micro-omgeving te simuleren die de cellen in vivo ondergaan. Daarom is …

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Het onderzoek werd uitgevoerd terwijl de auteur in ontvangst van “een Universiteit van West-Australië International Fee Scholarship en een University Postgraduate Award aan de Universiteit van West-Australië”. Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (81802214).

Materials

Ascorbic acid Sigma-aldrich PHR1008-2G
Fetal bovine serum (FBS) Gibcoä by Life Technologies 1908361
Histology processor Leica TP 1020
Minimal Essential Medium (Alpha-MEM) Gibcoä by Life Technologies 2003802
Mouse Tendon Derived Stem Cell Isolated from Achilles tendons of 6- to 8-wk-old C57BL/6 mice. Then digested with type I collagenase (3 mg/ml; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) for 3 h and passed through a 70 mmcell strainer to yield single-cell suspensions.
Paraformaldehyde Sigma-aldrich 441244
Streptomycin and penicillin mixture Gibcoä by Life Technologies 15140122
Three-dimensional Uniaxial Mechanical Stimulation Bioreactor System Centre of Orthopaedic Translational Research, Medical School, University of Western Australia Available from the corresponding author upon request. Or make it according to our design* *Wang T, Lin Z, Day RE, et al. Programmable mechanical stimulation influences tendon homeostasis in a bioreactor system. Biotechnol Bioeng. 2013;110(5):1495–1507. doi:10.1002/bit.24809
Trypsin Gibcoä by Life Technologies 1858331
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Knobloch, K., Yoon, U., Vogt, P. M. Acute and overuse injuries correlated to hours of training in master running athletes. Foot & Ankle International. 29 (7), 671-676 (2008).
  2. Kujala, U. M., Sarna, S., Kaprio, J. Cumulative incidence of achilles tendon rupture and tendinopathy in male former elite athletes. Clinical Journal of Sport Medicine. 15 (3), 133-135 (2005).
  3. Lian, O. B., Engebretsen, L., Bahr, R. Prevalence of jumper’s knee among elite athletes from different sports: a cross-sectional study. The American Journal of Sports Medicine. 33 (4), 561-567 (2005).
  4. Zwerver, J., Bredeweg, S. W., vanden Akker-Scheek, I. Prevalence of Jumper’s knee among nonelite athletes from different sports: a cross-sectional survey. The American Journal of Sports Medicine. 39 (9), 1984-1988 (2011).
  5. van der Worp, H., et al. Risk factors for patellar tendinopathy: a systematic review of the literature. British Journal of Sports Medicine. 45 (5), 446-452 (2011).
  6. Lopez, R. G. L., Jung, H. -. G. Achilles tendinosis: treatment options. Clinics in Orthopedic Surgery. 7 (1), 1-7 (2015).
  7. Wren, T. A., Yerby, S. A., Beaupré, G. S., Carter, D. R. Mechanical properties of the human achilles tendon. Clinical Biomechanics. 16 (3), 245-251 (2001).
  8. Rees, J. D., Wilson, A. M., Wolman, R. L. Current concepts in the management of tendon disorders. Rheumatology. 45 (5), 508-521 (2006).
  9. Magnan, B., Bondi, M., Pierantoni, S., Samaila, E. The pathogenesis of Achilles tendinopathy: a systematic review. Foot and Ankle Surgery. 20 (3), 154-159 (2014).
  10. Riley, G. The pathogenesis of tendinopathy. A molecular perspective. Rheumatology. 43 (2), 131-142 (2004).
  11. Bi, Y., et al. Identification of tendon stem/progenitor cells and the role of the extracellular matrix in their niche. Nature Medicine. 13 (10), 1219-1227 (2007).
  12. Zhang, J., Wang, J. H. C. BMP-2 mediates PGE(2) -induced reduction of proliferation and osteogenic differentiation of human tendon stem cells. Journal of Orthopaedic Research. 30 (2), 47-52 (2012).
  13. Chen, L., et al. Synergy of tendon stem cells and platelet-rich plasma in tendon healing. Journal of Orthopaedic Research. 30 (6), 991-997 (2012).
  14. Wang, J., et al. Mechanical stimulation orchestrates the osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells by regulating HDAC1. Cell Death & Disease. 7 (5), 2221 (2016).
  15. Parvizi, M., Bolhuis-Versteeg, L. A. M., Poot, A. A., Harmsen, M. C. Efficient generation of smooth muscle cells from adipose-derived stromal cells by 3D mechanical stimulation can substitute the use of growth factors in vascular Tissue Engineeringineering. Biotechnology Journal. 11 (7), 932-944 (2016).
  16. Sun, L., et al. Effects of Mechanical Stretch on Cell Proliferation and Matrix Formation of Mesenchymal Stem Cell and Anterior Cruciate Ligament Fibroblast. Stem Cells International. 2016, 9842075 (2016).
  17. Lin, X., Shi, Y., Cao, Y., Liu, W. Recent progress in stem cell differentiation directed by material and mechanical cues. Biomedical Materials. 11 (1), 014109 (2016).
  18. Li, R., et al. Mechanical strain regulates osteogenic and adipogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells. Biomed Research International. 2015, 873251 (2015).
  19. Zhang, J., Wang, J. H. C. Characterization of differential properties of rabbit tendon stem cells and tenocytes. BMC Musculoskeletal Disorders. 11, 10-10 (2010).
  20. Liu, X., Chen, W., Zhou, Y., Tang, K., Zhang, J. Mechanical Tension Promotes the Osteogenic Differentiation of Rat Tendon-derived Stem Cells Through the Wnt5a/Wnt5b/JNK Signaling Pathway. Cellular Physiology and Biochemistry. 36 (2), 517-530 (2015).
  21. Wang, T., et al. 3D uniaxial mechanical stimulation induces tenogenic differentiation of tendon-derived stem cells through a PI3K/AKT signaling pathway. FASEB Journal. 32 (9), 4804-4814 (2018).
  22. Calve, S., et al. Engineering of functional tendon. Tissue Engineering. 10 (5-6), 755-761 (2004).
  23. Kostrominova, T. Y., Calve, S., Arruda, E. M., Larkin, L. M. Ultrastructure of myotendinous junctions in tendon-skeletal muscle constructs engineered in vitro. Histology & Histopathology. 24 (5), 541-550 (2009).
  24. Wagner, J. R., Taguchi, T., Cho, J. Y., Charavaryamath, C., Griffon, D. J. Evaluation of Stem Cell Therapies in a Bilateral Patellar Tendon Injury Model in Rats. Journal of Visualized Experiments. (133), e56810 (2018).
  25. Kurtaliaj, I., Golman, M., Abraham, A. C., Thomopoulos, S. Biomechanical Testing of Murine Tendons. Journal of Visualized Experiments. (152), e60280 (2019).
  26. Hsiao, M. Y., et al. The Effect of the Repression of Oxidative Stress on Tenocyte Differentiation: A Preliminary Study of a Rat Cell Model Using a Novel Differential Tensile Strain Bioreactor. International Journal of Molecular Sciences. 20 (14), (2019).
  27. Morita, Y., et al. The optimal mechanical condition in stem cell-to-tenocyte differentiation determined with the homogeneous strain distributions and the cellular orientation control. Biology Open. 8 (5), 0339164 (2019).
  28. Shukunami, C., Oshima, Y., Hiraki, Y. Molecular cloning of tenomodulin, a novel chondromodulin-I related gene. Biochemical and Biophysical Research Communications. 280 (5), 1323-1327 (2001).
  29. Murchison, N. D., et al. Regulation of tendon differentiation by scleraxis distinguishes force-transmitting tendons from muscle-anchoring tendons. Development. 134 (14), 2697-2708 (2007).
  30. Liu, W., et al. The atypical homeodomain transcription factor Mohawk controls tendon morphogenesis. Molecular and Cellular Biology. 30 (20), 4797-4807 (2010).
  31. Chang, J., Thunder, R., Most, D., Longaker, M. T., Lineaweaver, W. C. Studies in flexor tendon wound healing: neutralizing antibody to TGF-beta1 increases postoperative range of motion. Plastic and Reconstructive Surgery. 105 (1), 148-155 (2000).
  32. Bennett, N. T., Schultz, G. S. Growth factors and wound healing: biochemical properties of growth factors and their receptors. American Journal of Surgery. 165 (6), 728-737 (1993).
  33. Wòjciak, B., Crossan, J. F. The effects of T cells and their products on in vitro healing of epitenon cell microwounds. Immunology. 83 (1), 93-98 (1994).
  34. Marui, T., et al. Effect of growth factors on matrix synthesis by ligament fibroblasts. Journal of Orthopaedic Research. 15 (1), 18-23 (1997).
  35. Ni, M., et al. Engineered scaffold-free tendon tissue produced by tendon-derived stem cells. Biomaterials. 34 (8), 2024-2037 (2013).
  36. Trumbull, A., Subramanian, G., Yildirim-Ayan, E. Mechanoresponsive musculoskeletal tissue differentiation of adipose-derived stem cells. Biomedical Engineering Online. 15, 43 (2016).
  37. Wang, T., et al. Programmable mechanical stimulation influences tendon homeostasis in a bioreactor system. Biotechnology and Bioengineering. 110 (5), 1495-1507 (2013).
  38. Nirmalanandhan, V. S., et al. Effect of scaffold material, construct length and mechanical stimulation on the in vitro stiffness of the engineered tendon construct. Journal of Biomechanics. 41 (4), 822-828 (2008).
  39. Doroski, D. M., Levenston, M. E., Temenoff, J. S. Cyclic tensile culture promotes fibroblastic differentiation of marrow stromal cells encapsulated in poly(ethylene glycol)-based hydrogels. Tissue Engineeringineering. Part A. 16 (11), 3457-3466 (2010).
  40. Altman, G. H., et al. Advanced bioreactor with controlled application of multi-dimensional strain for Tissue Engineeringineering. Journal of Biomechanical Engineering. 124 (6), 742-749 (2002).
  41. Webb, K., et al. Cyclic strain increases fibroblast proliferation, matrix accumulation, and elastic modulus of fibroblast-seeded polyurethane constructs. Journal of Biomechanics. 39 (6), 1136-1144 (2006).
  42. Parent, G., Huppé, N., Langelier, E. Low stress tendon fatigue is a relatively rapid process in the context of overuse injuries. Annals of Biomedical Engineering. 39 (5), 1535-1545 (2011).
  43. Wang, T., et al. Bioreactor design for tendon/ligament engineering. Tissue Engineeringineering. Part B, Reviews. 19 (2), 133-146 (2013).
  44. Smith, R. K. Mesenchymal stem cell therapy for equine tendinopathy. Disability and Rehabilitation. 30 (20-22), 1752-1758 (2008).
  45. Godwin, E. E., Young, N. J., Dudhia, J., Beamish, I. C., Smith, R. K. Implantation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells demonstrates improved outcome in horses with overstrain injury of the superficial digital flexor tendon. Journal of Equine Veterinary Science. 44 (1), 25-32 (2012).
  46. Lacitignola, L., Crovace, A., Rossi, G., Francioso, E. Cell therapy for tendinitis, experimental and clinical report. Veterinary Research Communications. 32, 33-38 (2008).
  47. Del Bue, M., et al. Equine adipose-tissue derived mesenchymal stem cells and platelet concentrates: their association in vitro and in vivo. Veterinary Research Communications. 32, 51-55 (2008).
  48. Awad, H. A., et al. Repair of patellar tendon injuries using a cell-collagen composite. Journal of Orthopaedic Research. 21 (3), 420-431 (2003).

Tags

Tendon-derived Stem CellsMechanical StimulationBioreactor SystemTenogenic DifferentiationTendinopathyCell Culture
check_url/pt/61278?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Chen, Z., Chen, P., Ruan, R., Chen, L., Yuan, J., Wood, D., Wang, T., Zheng, M. H. Applying a Three-dimensional Uniaxial Mechanical Stimulation Bioreactor System to Induce Tenogenic Differentiation of Tendon-Derived Stem Cells. J. Vis. Exp. (162), e61278, doi:10.3791/61278 (2020).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image