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Medicina

힘줄 유래 줄기 세포의 세포 분화를 유도하기 위해 3차원 동축 기계 자극 생물 반응기 시스템을 적용

Published: August 01, 2020
doi:
10.3791/61278
, , , , , , ,
1Centre of Orthopaedic Translational Research, Medical School,University of Western Australia

Summary

3차원 단방향 기계적 자극 생물반응기 시스템은 힘줄 유래 줄기 세포 및 신힘주 형성의 테노겐 특이적 분화를 위한 이상적인 생물반응기입니다.

Abstract

텐디노병증은 정형 외과 지역에서 염증과 변성과 관련된 일반적인 만성 힘줄 질환입니다. 높은 이환율, 제한된 자기 수리 능력, 그리고 가장 중요한 것은, 확실한 처리가 없는, 힘병증은 아직도 환자의 삶의 질을 부정적으로 영향을 미칩니다. 힘줄 세포의 1 차전구세포로서 힘줄 유래 줄기 세포(TDSC)는 힘줄병증의 발달과 힘줄병증 후기능및 구조적 복원 모두에서 필수적인 역할을 한다. 따라서, 시험관 내에서 TDSC의 생체 내 분화를 힘줄 세포로 모방할 수 있는 방법이 유용할 것이다. 여기서, 본 프로토콜은 TDSC를 자극하는 3차원(3D) 단종 스트레칭 시스템을 기반으로 하는 방법을 설명하여 힘줄과 같은 조직으로 분화한다. 현재 프로토콜의 7단계가 있다: 마우스 TDSC의 분리, 마우스 TDSC의 배양 및 확장, 세포 시트 형성을 위한 자극 배양 배지의 준비, 자극 매체에서 배양하여 세포 시트 형성, 3D 힘줄 줄기 세포 구성의 준비, 단축 스트레칭 기계 자극 복합체의 조립, 및 생체 외 조직과 같은 기계적 자극의 평가. 그 효과는 히스토로지에 의해 입증되었다. 전체 절차는 3주 미만이 소요됩니다. 세포외 매트릭스 증착을 촉진하기 위해, 4.4 mg/mL 아스코르브산은 자극 배양 배지에 사용되었다. 선형 모터가 있는 분리된 챔버는 정확한 기계적 적재를 제공하며 이식성이 뛰어나고 쉽게 조절되어 생물 반응기에 적용됩니다. 본 프로토콜의 로딩 정권은 6% 변형, 0.25Hz, 8h, 6일 동안 16h 휴게되었다. 이 프로토콜은 힘줄에서 세포 분화를 모방 할 수 있으며, 이는 건병증의 병리학 적 과정을 조사하는 데 도움이됩니다. 더욱이, 힘줄 같이 조직은 잠재적으로 조작된 자가 이식으로 힘줄 상해에 있는 힘줄 치유를 승진시키기 위하여 이용됩니다. 요약하자면, 현재 프로토콜은 간단하고 경제적이며 재현 가능하며 유효합니다.

Introduction

텐디노병증은 일반적인 스포츠 부상 중 하나입니다. 그것은 주로 통증에 의해 명시, 로컬 붓기, 영향 받는 지역에 근육 긴장 감소, 그리고 기능 장애. 건공병증의 부각은 높다. 아킬레스건병증의 존재는 중장거리 주자(최대 29%)에게 가장 흔한 반면, 슬개골 건비병증의 존재는 배구(45%), 농구(32%), 육상(23%), 핸드볼(15%), 축구(13%)1,,2,,3,,4,,5등에서도높다. 그러나, 힘줄의 제한된 자기 치유 능력, 효과적인 치료의 부족으로 인해, 힘병증은 여전히 환자의 삶에 부정적인 영향을6,,7. 더욱이, 건근병증의 병인은 불분명합니다. 주로 ‘염증론’, ‘변성론’, ‘남용이론’, ‘남용이론’ 등 발병기발병에 대한 많은 조사가있었다. 현재, 많은 연구자들은 힘줄 경험9,,10과함께 과도한 기계적 적재로 인한 미세 부상에 대한 자가 수리에 실패한 것으로 판단했다.

힘줄 세포의 1차 전구체 세포로서 힘줄 유래 줄기 세포(TDSC)는,건반병증11,,12,13이후의 건근병증 및 기능적 및 구조적 복원의 발달 모두에서 필수적인 역할을 한다. 기계적 스트레스 자극은 골세포, 골세포, 매끄러운 근육 세포, 섬유아세포, 중간엽줄기세포 및 기타 힘에 민감한 세포14,,15,,16,,17,,18의증식 및 분화를 일으킬 수 있다고 보고되었다. 따라서, TDSC는, 메카노민감성 및 다능성 세포 중 하나로서, 기계적적재(19,,20)로분화하도록 유사하게 자극될 수 있다.

그러나, 다른 기계적 적재 파라미터(적재 강도, 하중 주파수, 적재 유형 및 적재 기간)는 TDSC를 유도하여 다른셀(21)으로분화하도록 유도할 수 있다. 따라서 효과적이고 유효한 기계적 로딩 정권은 tenogenesis에 매우 중요합니다. 또한 현재 TDSC에 기계적 로딩을 제공하는 데 사용되는 자극 시스템으로 다양한 종류의 생물 반응기가 있습니다. 생물 반응기의 각 종류의 원리는 다르므로 다른 생물 반응기에 대응하는 기계적 적재 매개 변수도 다릅니다. 따라서, 간단하고 경제적이며 재현 가능한 자극 프로토콜은 생물 반응기의 유형, 해당 자극 매체 및 기계적 적재 체제를 포함하는 수요가 있다.

본 기사는 TDSC를 자극하여 힘줄과 같은 조직으로 분화하는 3차원(3D) 항축 스트레칭 시스템을 기반으로 하는 방법을 설명합니다. 프로토콜의 7단계가 있다: 마우스 TDSC의 격리, 마우스 TDSC의 배양 및 확장, 세포 시트 형성을 위한 자극 배양 배지의 준비, 자극 매체에서 배양하여 세포 시트 형성, 3D 힘줄 줄기 세포 생성의 준비, 단축 스트레칭 기계 자극 복합체의 조립, 및 시험관 조직과 같은 기계적 자극의 평가. 전체 절차는 3D 세포 구조를 얻는 데 3 주 미만이 걸리며, 이는 일부 기존방법(22,,23)보다훨씬 적습니다. 본 프로토콜은 TDSC를 힘줄 조직으로 분화하도록 유도할 수 있는 것으로 입증되었으며, 현재 일반적으로 사용되는 2차원(2D) 스트레치시스템(21)보다더 신뢰할 수 있다. 그 효과는 히스토로지에 의해 입증되었다. 요컨대, 현재 프로토콜은 간단하고 경제적이며 재현 가능하며 유효합니다.

Protocol

설명된 방법은 웨스턴 오스트레일리아 동물 윤리 위원회의 지침 및 규정에 따라 승인되고 수행되었습니다. 1. 마우스 TDSC의 격리 자궁 경부 탈구에 의해 6-8 주 된 C57BL/6 마우스를 안락사. 수확 슬개골 힘줄(24 및 아킬레스 건25) 3 시간 동안 6 mL 타입 I 콜라게나아제 (3 mg/mL)를 가진 하나에서 힘줄을 소화합니다.참고: 마…

Representative Results

기계적 자극 전에 TDSC는 완전한 매체에서 100% 합류로 성장하여 무질서한 초구조적형태(도 2A)를표시하였다. 6일 간의 단종 스트레칭 기계적 하중 후, 세포외 매트릭스(ECM) 및 세포 정렬은 잘 지향되었다(도2B). 세포는 기계적 적재 후 ECM에 잘 채워지고 잘 포위되었습니다. 세포 형태는 길어지게 되어, 스트레칭없이 에 비해 정상 힘줄 세포와 더 유사하였다(도2C). …

Discussion

힘줄은 메카노감과성 섬유성 결합 조직입니다. 이전 연구에 따르면, 과도한 기계적 적재는 힘줄 줄기 세포의 골성 분화로 이어질 수 있지만, 부전이 부족하면 힘줄분화(21)가무질서한 콜라겐 섬유 구조로 이어질 수 있다.

일반적인 견해는 이상적인 생물 반응기의 열쇠는 생체 내 세포가 겪는 체외 세포 미세 환경을 시뮬레이션하는 능력입니다. 따라서, 시험?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

저자는 “웨스턴 오스트레일리아 대학 국제 료 장학금과 웨스턴 오스트레일리아 대학에서 대학 대학원 상”을 받는 동안 연구가 수행되었다. 이 작품은 중국 국립 자연 과학 재단 (81802214)에 의해 지원되었다.

Materials

Ascorbic acid Sigma-aldrich PHR1008-2G
Fetal bovine serum (FBS) Gibcoä by Life Technologies 1908361
Histology processor Leica TP 1020
Minimal Essential Medium (Alpha-MEM) Gibcoä by Life Technologies 2003802
Mouse Tendon Derived Stem Cell Isolated from Achilles tendons of 6- to 8-wk-old C57BL/6 mice. Then digested with type I collagenase (3 mg/ml; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) for 3 h and passed through a 70 mmcell strainer to yield single-cell suspensions.
Paraformaldehyde Sigma-aldrich 441244
Streptomycin and penicillin mixture Gibcoä by Life Technologies 15140122
Three-dimensional Uniaxial Mechanical Stimulation Bioreactor System Centre of Orthopaedic Translational Research, Medical School, University of Western Australia Available from the corresponding author upon request. Or make it according to our design* *Wang T, Lin Z, Day RE, et al. Programmable mechanical stimulation influences tendon homeostasis in a bioreactor system. Biotechnol Bioeng. 2013;110(5):1495–1507. doi:10.1002/bit.24809
Trypsin Gibcoä by Life Technologies 1858331
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Chen, Z., Chen, P., Ruan, R., Chen, L., Yuan, J., Wood, D., Wang, T., Zheng, M. H. Applying a Three-dimensional Uniaxial Mechanical Stimulation Bioreactor System to Induce Tenogenic Differentiation of Tendon-Derived Stem Cells. J. Vis. Exp. (162), e61278, doi:10.3791/61278 (2020).
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