JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicina

Tendon Türevi Kök Hücrelerin Tenojenik Farklılaşmasını İndüklemek Için Üç Boyutlu Tek Eksenel Mekanik Stimülasyon Biyoreaktör Sistemi Uygulama

Published: August 01, 2020
doi:
10.3791/61278
, , , , , , ,
1Centre of Orthopaedic Translational Research, Medical School,University of Western Australia

Summary

Üç boyutlu tek boyutlu tek eksenli mekanik stimülasyon biyoreaktör sistemi tendon kaynaklı kök hücrelerin tenojenik spesifik farklılaşması ve neo-tendon oluşumu için ideal bir biyoreaktördür.

Abstract

Tendinopati bir ortopedik alanda inflamasyon ve dejenerasyon ile ilgili yaygın bir kronik tendon hastalığıdır. Yüksek morbidite, sınırlı kendi kendini onarma kapasitesi ve en önemlisi kesin tedaviler iyatsi olmaması yla, tendinopati hala hastaların yaşam kalitesini olumsuz etkilemez. Tendon kaynaklı kök hücreler (TDSCs), tendon hücrelerinin birincil öncü hücreleri olarak, tendinopati nin gelişiminde ve tendinopati sonrası fonksiyonel ve yapısal restorasyonda önemli bir rol oynamaktadır. Böylece, in vitro tendon hücrelerine TDSCs in vivo farklılaşma taklit edebilirsiniz bir yöntem yararlı olacaktır. Burada, bu protokol tendon benzeri dokulara farklılaşmak için TDSCs uyarmak için üç boyutlu (3D) tek eksenli germe sistemi dayalı bir yöntem açıklar. Bu protokolün yedi aşaması vardır: farelerin TDSC’lerinin izolasyonu, fare TDSC’lerinin kültürü ve genişlemesi, hücre tabakasının oluşumu için stimülasyon kültür ortamının hazırlanması, stimülasyon ortamında kültür oluşturma yoluyla hücre sayfası oluşumu, 3D tendon kök hücre yapısının hazırlanması, tek eksenli germe mekanik stimülasyon kompleksinin montajı ve mekanik uyarılmış in vitro tendon benzeri dokunun değerlendirilmesi. Etkinliğini histoloji ile gösterilmiştir. Tüm işlem 3 haftadan az sürer. Ekstrasellüler matriks birikimini teşvik etmek için stimülasyon kültürü ortamda 4.4 mg/mL askorbik asit kullanıldı. Lineer motorlu ayrılmış bir hazne doğru mekanik yükleme sağlar ve biyoreaktör için uygulanan taşınabilir ve kolayca ayarlanabilir. Mevcut protokoldeki yükleme rejimi %6 gerinim, 0.25 Hz, 8 saat, ardından 6 gün boyunca 16 saat istirahat edildi. Bu protokol tendondaki hücre farklılaşmasını taklit edebilir, bu da tendinopatinin patolojik sürecinin araştırılmasında yararlıdır. Ayrıca, tendon benzeri doku potansiyel olarak tasarlanmış bir otolog greft olarak tendon yaralanması tendon iyileşmesi teşvik etmek için kullanılır. Özetle, mevcut protokol basit, ekonomik, tekrarlanabilir ve geçerlidir.

Introduction

Tendinopati yaygın spor yaralanmalarından biridir. Esas olarak ağrı ile kendini gösterir, lokal şişlik, etkilenen bölgede azalmış kas gerginliği, ve disfonksiyon. Tendinopati insidansı yüksektir. Aşil tendinopati varlığı orta ve uzun mesafe koşucuları için en sık görülür (kadar 29%), patellar tendinopati varlığı da voleybol sporcular yüksek iken (%45),% 45), basketbol (%32), atletizm (%23), hentbol (%15), ve futbol (%13)1,2,3,4,5. Ancak, tendonun sınırlı kendi kendine iyileşme yeteneği nedeniyle, ve etkili tedavilerin eksikliği, tendinopati hala olumsuz hastaların hayatını etkiler6,7. Ayrıca, tendinopati patogenezi belirsizliğini korumaktadır. “İltihap teorisi”, “dejenerasyon teorisi”, “aşırı kullanım teorisi” ve benzeri8dahil olmak üzere patogenezi hakkında birçok araştırma yapılmıştır. Şu anda, birçok araştırmacı tendinopati tendon deneyimleri aşırı mekanik yükleme neden mikro yaralanmalar başarısız kendi kendine onarım nedeniyle olduğuna inanıyordu9,10.

Tendon türetilmiş kök hücreler (TDSCs), tendon hücrelerinin birincil öncü hücreleri olarak, tendinopati ve fonksiyonel ve yapısal restorasyon tendinopati11sonra hem gelişiminde önemli bir rol oynamaktadır11 ,12,13. Bu mekanik stres stimülasyonu proliferasyon ve osteositler, osteoblastlar, düz kas hücreleri, fibroblastlar, mezenkimal kök hücreler ve diğer kuvvete duyarlı hücreler14,,15,16,17,18farklılaşmasına neden olabileceği bildirilmiştir . Bu nedenle, TDSCs, mekanosensitive ve multipotent hücrelerden biri olarak, benzer mekanik yükleme19,20ile ayırt etmek için uyarılabilir.

Ancak, farklı mekanik yükleme parametreleri (yükleme mukavemeti, yükleme frekansı, yükleme türü ve yükleme süresi) farklı hücrelere21ayırt etmek için TDSCs neden olabilir. Bu nedenle tenogenez için etkili ve geçerli bir mekanik yükleme rejimi çok önemlidir. Ayrıca, şu anda TDSCs mekanik yükleme sağlamak için kullanılan stimülasyon sistemleri olarak biyoreaktörler farklı türleri vardır. Her tür biyoreaktörün prensipleri farklıdır, bu nedenle farklı biyoreaktörlere karşılık gelen mekanik yükleme parametreleri de farklıdır. Bu nedenle, biyoreaktör türü, ilgili stimülasyon ortamı ve mekanik yükleme rejimi de dahil olmak üzere basit, ekonomik ve tekrarlanabilir stimülasyon protokolü talep görmektedir.

Bu makalede, TDSC’leri tendon benzeri dokuya ayırmak için uyarmak için üç boyutlu (3D) tek eksenli germe sistemine dayalı bir yöntem açıklanmaktadır. Protokolün yedi aşaması vardır: farelerin TDSC’lerinin izolasyonu, fare TDSC’lerinin kültürü ve genişlemesi, hücre tabakasının oluşumu için stimülasyon kültür ortamının hazırlanması, stimülasyon ortamında kültür oluşturma yoluyla hücre sayfası oluşumu, 3D tendon kök hücre yapısının hazırlanması, tek eksenli germe mekanik stimülasyon kompleksinin montajı ve mekanik uyarılmış in vitro tendon benzeri dokunun değerlendirilmesi. Tüm prosedür çok bazı mevcutyöntemler22,23daha az 3D hücre yapısı, elde etmek için 3 haftadan az sürer. Mevcut protokol tendon dokusu na farklılaştırmak için TDSCs ikna edebilmek için kanıtlanmıştır, ve daha mevcut kullanılan iki boyutlu daha güvenilir (2D) germe sistemi21. Etkinliğini histoloji ile gösterilmiştir. Kısacası, mevcut protokol basit, ekonomik, tekrarlanabilir ve geçerlidir.

Protocol

Açıklanan yöntemler, Batı Avustralya Üniversitesi Hayvan Etik Komitesi’nin yönergeleri ve yönetmeliklerine uygun olarak onaylanmış ve gerçekleştirilmiştir. 1. Fare TDSC’lerinin İzolasyon 6-8 haftalık C57BL/6 farelerini servikal çıkığı ile ötenazi. Hasat patellar tendonu24 ve Aşil tendonu25. Tip I kollajenaz (3 mg/mL) 6 mL olan birinden sindirin tendon 3 saat.NOT: Faredeki tendon boyutu küç?…

Representative Results

Mekanik stimülasyondan önce TDSC’ler tam ortamda 0 biraraya gelir ve düzensiz bir ultrayapısal morfoloji gösterilmiştir(Şekil 2A). 6 günlük tek eksenli germe mekanik yüklemeden sonra, hücre dışı matriks (ECM) ve hücre hizalamaları iyi yönlendirilmiştir(Şekil 2B). Hücreler iyi doldurulur ve mekanik yükleme den sonra ECM’de iyi zarflanmış. Hücre morfolojisi uzatılmış olarak sunuldu ve esneme denkemeyen hücreye göre normal tendon hücresine daha çok benziyor…

Discussion

Tendon mekanosiz fibröz bağ dokusudur. Önceki araştırmalara göre, aşırı mekanik yükleme tendon kök hücrelerinin osteojenik farklılaşmasına yol açabilir, yetersiz yükleme tendon farklılaşması sırasında düzensiz kollajen lif yapısına yol açacak ise21.

Ortak bir görüş, ideal bir biyoreaktör için anahtar in vitro hücresel mikroenvironment hücreler in vivo geçmesi simüle yeteneği olmasıdır. Bu nedenle, in vivo normal stres ortamını in …

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Araştırma, yazar “Batı Avustralya Üniversitesi Uluslararası Ücret Bursu ve Batı Avustralya Üniversitesi’nde Üniversite Yüksek Lisans Ödülü” alırken gerçekleştirildi. Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81802214) tarafından desteklenmiştir.

Materials

Ascorbic acid Sigma-aldrich PHR1008-2G
Fetal bovine serum (FBS) Gibcoä by Life Technologies 1908361
Histology processor Leica TP 1020
Minimal Essential Medium (Alpha-MEM) Gibcoä by Life Technologies 2003802
Mouse Tendon Derived Stem Cell Isolated from Achilles tendons of 6- to 8-wk-old C57BL/6 mice. Then digested with type I collagenase (3 mg/ml; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) for 3 h and passed through a 70 mmcell strainer to yield single-cell suspensions.
Paraformaldehyde Sigma-aldrich 441244
Streptomycin and penicillin mixture Gibcoä by Life Technologies 15140122
Three-dimensional Uniaxial Mechanical Stimulation Bioreactor System Centre of Orthopaedic Translational Research, Medical School, University of Western Australia Available from the corresponding author upon request. Or make it according to our design* *Wang T, Lin Z, Day RE, et al. Programmable mechanical stimulation influences tendon homeostasis in a bioreactor system. Biotechnol Bioeng. 2013;110(5):1495–1507. doi:10.1002/bit.24809
Trypsin Gibcoä by Life Technologies 1858331
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Knobloch, K., Yoon, U., Vogt, P. M. Acute and overuse injuries correlated to hours of training in master running athletes. Foot & Ankle International. 29 (7), 671-676 (2008).
  2. Kujala, U. M., Sarna, S., Kaprio, J. Cumulative incidence of achilles tendon rupture and tendinopathy in male former elite athletes. Clinical Journal of Sport Medicine. 15 (3), 133-135 (2005).
  3. Lian, O. B., Engebretsen, L., Bahr, R. Prevalence of jumper’s knee among elite athletes from different sports: a cross-sectional study. The American Journal of Sports Medicine. 33 (4), 561-567 (2005).
  4. Zwerver, J., Bredeweg, S. W., vanden Akker-Scheek, I. Prevalence of Jumper’s knee among nonelite athletes from different sports: a cross-sectional survey. The American Journal of Sports Medicine. 39 (9), 1984-1988 (2011).
  5. van der Worp, H., et al. Risk factors for patellar tendinopathy: a systematic review of the literature. British Journal of Sports Medicine. 45 (5), 446-452 (2011).
  6. Lopez, R. G. L., Jung, H. -. G. Achilles tendinosis: treatment options. Clinics in Orthopedic Surgery. 7 (1), 1-7 (2015).
  7. Wren, T. A., Yerby, S. A., Beaupré, G. S., Carter, D. R. Mechanical properties of the human achilles tendon. Clinical Biomechanics. 16 (3), 245-251 (2001).
  8. Rees, J. D., Wilson, A. M., Wolman, R. L. Current concepts in the management of tendon disorders. Rheumatology. 45 (5), 508-521 (2006).
  9. Magnan, B., Bondi, M., Pierantoni, S., Samaila, E. The pathogenesis of Achilles tendinopathy: a systematic review. Foot and Ankle Surgery. 20 (3), 154-159 (2014).
  10. Riley, G. The pathogenesis of tendinopathy. A molecular perspective. Rheumatology. 43 (2), 131-142 (2004).
  11. Bi, Y., et al. Identification of tendon stem/progenitor cells and the role of the extracellular matrix in their niche. Nature Medicine. 13 (10), 1219-1227 (2007).
  12. Zhang, J., Wang, J. H. C. BMP-2 mediates PGE(2) -induced reduction of proliferation and osteogenic differentiation of human tendon stem cells. Journal of Orthopaedic Research. 30 (2), 47-52 (2012).
  13. Chen, L., et al. Synergy of tendon stem cells and platelet-rich plasma in tendon healing. Journal of Orthopaedic Research. 30 (6), 991-997 (2012).
  14. Wang, J., et al. Mechanical stimulation orchestrates the osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells by regulating HDAC1. Cell Death & Disease. 7 (5), 2221 (2016).
  15. Parvizi, M., Bolhuis-Versteeg, L. A. M., Poot, A. A., Harmsen, M. C. Efficient generation of smooth muscle cells from adipose-derived stromal cells by 3D mechanical stimulation can substitute the use of growth factors in vascular Tissue Engineeringineering. Biotechnology Journal. 11 (7), 932-944 (2016).
  16. Sun, L., et al. Effects of Mechanical Stretch on Cell Proliferation and Matrix Formation of Mesenchymal Stem Cell and Anterior Cruciate Ligament Fibroblast. Stem Cells International. 2016, 9842075 (2016).
  17. Lin, X., Shi, Y., Cao, Y., Liu, W. Recent progress in stem cell differentiation directed by material and mechanical cues. Biomedical Materials. 11 (1), 014109 (2016).
  18. Li, R., et al. Mechanical strain regulates osteogenic and adipogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells. Biomed Research International. 2015, 873251 (2015).
  19. Zhang, J., Wang, J. H. C. Characterization of differential properties of rabbit tendon stem cells and tenocytes. BMC Musculoskeletal Disorders. 11, 10-10 (2010).
  20. Liu, X., Chen, W., Zhou, Y., Tang, K., Zhang, J. Mechanical Tension Promotes the Osteogenic Differentiation of Rat Tendon-derived Stem Cells Through the Wnt5a/Wnt5b/JNK Signaling Pathway. Cellular Physiology and Biochemistry. 36 (2), 517-530 (2015).
  21. Wang, T., et al. 3D uniaxial mechanical stimulation induces tenogenic differentiation of tendon-derived stem cells through a PI3K/AKT signaling pathway. FASEB Journal. 32 (9), 4804-4814 (2018).
  22. Calve, S., et al. Engineering of functional tendon. Tissue Engineering. 10 (5-6), 755-761 (2004).
  23. Kostrominova, T. Y., Calve, S., Arruda, E. M., Larkin, L. M. Ultrastructure of myotendinous junctions in tendon-skeletal muscle constructs engineered in vitro. Histology & Histopathology. 24 (5), 541-550 (2009).
  24. Wagner, J. R., Taguchi, T., Cho, J. Y., Charavaryamath, C., Griffon, D. J. Evaluation of Stem Cell Therapies in a Bilateral Patellar Tendon Injury Model in Rats. Journal of Visualized Experiments. (133), e56810 (2018).
  25. Kurtaliaj, I., Golman, M., Abraham, A. C., Thomopoulos, S. Biomechanical Testing of Murine Tendons. Journal of Visualized Experiments. (152), e60280 (2019).
  26. Hsiao, M. Y., et al. The Effect of the Repression of Oxidative Stress on Tenocyte Differentiation: A Preliminary Study of a Rat Cell Model Using a Novel Differential Tensile Strain Bioreactor. International Journal of Molecular Sciences. 20 (14), (2019).
  27. Morita, Y., et al. The optimal mechanical condition in stem cell-to-tenocyte differentiation determined with the homogeneous strain distributions and the cellular orientation control. Biology Open. 8 (5), 0339164 (2019).
  28. Shukunami, C., Oshima, Y., Hiraki, Y. Molecular cloning of tenomodulin, a novel chondromodulin-I related gene. Biochemical and Biophysical Research Communications. 280 (5), 1323-1327 (2001).
  29. Murchison, N. D., et al. Regulation of tendon differentiation by scleraxis distinguishes force-transmitting tendons from muscle-anchoring tendons. Development. 134 (14), 2697-2708 (2007).
  30. Liu, W., et al. The atypical homeodomain transcription factor Mohawk controls tendon morphogenesis. Molecular and Cellular Biology. 30 (20), 4797-4807 (2010).
  31. Chang, J., Thunder, R., Most, D., Longaker, M. T., Lineaweaver, W. C. Studies in flexor tendon wound healing: neutralizing antibody to TGF-beta1 increases postoperative range of motion. Plastic and Reconstructive Surgery. 105 (1), 148-155 (2000).
  32. Bennett, N. T., Schultz, G. S. Growth factors and wound healing: biochemical properties of growth factors and their receptors. American Journal of Surgery. 165 (6), 728-737 (1993).
  33. Wòjciak, B., Crossan, J. F. The effects of T cells and their products on in vitro healing of epitenon cell microwounds. Immunology. 83 (1), 93-98 (1994).
  34. Marui, T., et al. Effect of growth factors on matrix synthesis by ligament fibroblasts. Journal of Orthopaedic Research. 15 (1), 18-23 (1997).
  35. Ni, M., et al. Engineered scaffold-free tendon tissue produced by tendon-derived stem cells. Biomaterials. 34 (8), 2024-2037 (2013).
  36. Trumbull, A., Subramanian, G., Yildirim-Ayan, E. Mechanoresponsive musculoskeletal tissue differentiation of adipose-derived stem cells. Biomedical Engineering Online. 15, 43 (2016).
  37. Wang, T., et al. Programmable mechanical stimulation influences tendon homeostasis in a bioreactor system. Biotechnology and Bioengineering. 110 (5), 1495-1507 (2013).
  38. Nirmalanandhan, V. S., et al. Effect of scaffold material, construct length and mechanical stimulation on the in vitro stiffness of the engineered tendon construct. Journal of Biomechanics. 41 (4), 822-828 (2008).
  39. Doroski, D. M., Levenston, M. E., Temenoff, J. S. Cyclic tensile culture promotes fibroblastic differentiation of marrow stromal cells encapsulated in poly(ethylene glycol)-based hydrogels. Tissue Engineeringineering. Part A. 16 (11), 3457-3466 (2010).
  40. Altman, G. H., et al. Advanced bioreactor with controlled application of multi-dimensional strain for Tissue Engineeringineering. Journal of Biomechanical Engineering. 124 (6), 742-749 (2002).
  41. Webb, K., et al. Cyclic strain increases fibroblast proliferation, matrix accumulation, and elastic modulus of fibroblast-seeded polyurethane constructs. Journal of Biomechanics. 39 (6), 1136-1144 (2006).
  42. Parent, G., Huppé, N., Langelier, E. Low stress tendon fatigue is a relatively rapid process in the context of overuse injuries. Annals of Biomedical Engineering. 39 (5), 1535-1545 (2011).
  43. Wang, T., et al. Bioreactor design for tendon/ligament engineering. Tissue Engineeringineering. Part B, Reviews. 19 (2), 133-146 (2013).
  44. Smith, R. K. Mesenchymal stem cell therapy for equine tendinopathy. Disability and Rehabilitation. 30 (20-22), 1752-1758 (2008).
  45. Godwin, E. E., Young, N. J., Dudhia, J., Beamish, I. C., Smith, R. K. Implantation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells demonstrates improved outcome in horses with overstrain injury of the superficial digital flexor tendon. Journal of Equine Veterinary Science. 44 (1), 25-32 (2012).
  46. Lacitignola, L., Crovace, A., Rossi, G., Francioso, E. Cell therapy for tendinitis, experimental and clinical report. Veterinary Research Communications. 32, 33-38 (2008).
  47. Del Bue, M., et al. Equine adipose-tissue derived mesenchymal stem cells and platelet concentrates: their association in vitro and in vivo. Veterinary Research Communications. 32, 51-55 (2008).
  48. Awad, H. A., et al. Repair of patellar tendon injuries using a cell-collagen composite. Journal of Orthopaedic Research. 21 (3), 420-431 (2003).

Tags

Tendon-derived Stem CellsMechanical StimulationBioreactor SystemTenogenic DifferentiationTendinopathyCell Culture
check_url/pt/61278?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Chen, Z., Chen, P., Ruan, R., Chen, L., Yuan, J., Wood, D., Wang, T., Zheng, M. H. Applying a Three-dimensional Uniaxial Mechanical Stimulation Bioreactor System to Induce Tenogenic Differentiation of Tendon-Derived Stem Cells. J. Vis. Exp. (162), e61278, doi:10.3791/61278 (2020).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image