Trazado anatómico y funcional combinado in vivo de terminales de glutamato del área tegmental ventral en el hipocampo
Summary
El protocolo actual demuestra un método simple para el rastreo de las proyecciones de glutamato del área tegmental ventral (VTA) al hipocampo. La fotoestimulación de las neuronas de glutamato VTA se combinó con el registro de CA1 para demostrar cómo los terminales de glutamato VTA modulan la tasa de disparo piramidal putativa CA1 in vivo.
Abstract
La modulación optogenética de las subpoblaciones neuronales en el cerebro ha permitido a los investigadores diseccionar los circuitos neuronales in vivo y ex vivo. Esto proporciona una premisa para determinar el papel de los tipos de neuronas dentro de un circuito neuronal y su importancia en la codificación de la información en relación con el aprendizaje. Del mismo modo, el método se puede utilizar para probar la importancia fisiológica de dos o más regiones cerebrales conectadas en animales despiertos y anestesiados. El estudio actual demuestra cómo las neuronas de glutamato VTA modulan la tasa de disparo de las neuronas piramidales putativas en el CA1 (hipocampo) de ratones anestesiados. Este protocolo emplea el etiquetado dependiente del virus adenoasociado (AAV) de las neuronas de glutamato VTA para el rastreo de los terminales presinápticos de glutamato VTA en las capas del hipocampo. La expresión de opsina controlada por la luz (canalrodopsina; hChR2) y proteína de fluorescencia (eYFP) albergada por el vector AAV permitió el rastreo anterógrado de los terminales de glutamato VTA y la fotoestimulación de los cuerpos celulares de las neuronas de glutamato VTA (en el VTA). Se colocaron electrodos de silicio agudo de alta impedancia en el CA1 para detectar respuestas de unidades múltiples y de una sola unidad a la fotoestimulación VTA in vivo. Los resultados de este estudio demuestran la distribución dependiente de capas de los terminales presinápticos de glutamato VTA en el hipocampo (CA1, CA3 y DG). Además, la fotoestimulación de las neuronas VTA glutamato aumentó la velocidad de disparo y estallido de las supuestas unidades piramidales CA1 in vivo.
Introduction
En la última década, se desarrolló una serie de herramientas genéticas para aumentar la especificidad de la modulación de tipo neuronal y el mapeo de redes neuronales complejas1. En particular, los virus neurotrópicos con una capacidad inherente para infectar y replicarse en las células neuronales se han desplegado para expresar o extirpar proteínas específicas en subclases de neuronas. Al albergar proteínas de fluorescencia o indicadores de actividad sináptica codificados genéticamente, los vectores AAV transfectados etiquetan y delinean las redes neuronales a través de las regiones cerebrales2,3. La elección de un promotor en el constructo AAV dirige la expresión del vector en tipos de neuronas con cierto nivel de especificidad (expresióndependiente del promotor). Sin embargo, a través de la recombinación de Cre-lox, los constructos AAV se despliegan con mayor especificidad para el etiquetado neuronal4,5,6,7. Cabe destacar que las opsinas microbianas fotoactivadas y las proteínas de fluorescencia empaquetadas en vectores AAV se pueden expresar en varios subtipos de neuronas8,y son ideales para imágenes, trazado de circuitos de tipo neuronal y fotomodulación9,10.
Las construcciones de AAV inyectadas estereotácticamente en una región del cerebro (o núcleo) impulsan la expresión de la proteína reportera en los terminales soma, dendrita y axones. La expresión neuronal de AAV que alberga un gen reportero (eYFP) facilita el etiquetado de los cuerpos celulares de las neuronas y el rastreo anatómico de las proyecciones hacia y desde otras regiones del cerebro11,12,13,14. Las construcciones AAV-eYFP que transportan opsina controlada por la luz (por ejemplo, hChR2), se pueden implementar como una herramienta para obtener imágenes6,15 y el rastreo fisiológico basado en la estimulación de proyecciones neuronales para apuntar a áreas cerebrales in vivo16. Dependiendo del serotipo AAV, la dirección del etiquetado neuronal puede ser anterógrada o retrógrada11,12. Estudios previos han establecido que AAV5 viaja anterógradamente en las neuronas12. Así, la fotoestimulación de cuerpos celulares que expresan hChR2 produce efectos presinápticos en otras partes del cerebro (diana)17.
Aquí, AAV (serotipo 5) con un promotor CaMKIIα se utilizó para expresar eYFP (reportero) y hChR2 (opsina) en neuronas glutamato VTA y proyecciones axonales. Los resultados de este estudio demuestran la distribución dependiente de capas de los terminales presinápticos VTA-glutamato en las regiones del hipocampo CA1, CA3 y DG. Además, la fotoestimulación de las neuronas de glutamato VTA aumentó las tasas de disparo in vivo de ca1 de varias unidades y unidades únicas en comparación con los valores basales. Este protocolo utiliza herramientas asequibles y software disponible comercialmente que puede aumentar la calidad de los datos obtenidos de los experimentos de rastreo de circuitos neuronales.
Protocol
Representative Results
Discussion
En la última década, el diseño de las construcciones AAV ha avanzado significativamente. Como tal, se han incorporado más promotores específicos de neuronas en una serie de serotipos AAV para mejorar la especificidad de la transfección14. Al combinar genes para proteínas de fluorescencia, transportadores, receptores y canales iónicos, ahora existen bibliotecas de AAV para imágenes, neuromodulación y detección de actividad sináptica. En construcciones AAV disponibles comercialmente, una…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo está financiado por CBS Bridging Grant otorgado a OOM. OOM, PAA y AS diseñaron el estudio y realizaron los experimentos. AS y PAA analizaron los resultados. OOM y PAA prepararon el manuscrito. Agradecemos al Dr. Karl Disseroth (Universidad de Stanford) por hacer que el AAV esté disponible para nuestro uso.
Materials
| 3% Hydrogen peroxide | Fisher chemical | H312 | |
| AAV-CaMKIIα-ChR2-eGYP | Addgene | Plasmid #26969 | |
| BNC cable | Amazon | ||
| BNC Splitter | Amazon | ||
| Ceramic Split Mating Sleeve for Ø1.25mm Ferrules. | Thorlabs | ADAL1-5 | |
| Drill | Dremel | LR 39098 | |
| Gelatin coated slides | Fisher scientific | OBSLD01CS | |
| Hamilton's syringe (Neuros) | WPI Inc. | 06H | |
| Head stage adapter | Neuronexus | Adpt-Q4-OM32 | |
| High impedance silicon probe | Neuronexus | Q1x1-tet-5mm-121-CQ4 | |
| INTAN 512ch Recording Controller | INTAN | RHD2000 | |
| Iodine solution | Dynarex | 1425 | |
| Isoflurane | Piramal | NDC 66794-017-25 | |
| Ketamine | Spectrum | K1068 | |
| LED Driver | Thorlabs | LEDD1B | |
| LED light source (470 nm)-blue light | Thorlabs | M470F3 | |
| Micromanipulator | Narishige | M0-203 | |
| Optic fiber | Thorlabs | CFMLC14L05 | |
| Pan head philips screw (M0.6 X 2mm) | Amazon | M0.6 X 2mm | |
| Pre-amplifier headstage (32 Channel) | INTAN | C3314 | |
| Stereotaxic frame | Kopf | 1530 | |
| TTL pulser | Prizmatix | 4031 | |
| Urethane | Sigma | U2500 | |
| Xylazine | Alfa Aesar | J61430 | |
| Software | Company | Version | |
| Graphpad Prism | |||
| Intan Recording Controller | |||
| Neuroexplorer | |||
| Plexon Offline Spike Sorter | |||
| ACSF Composition: | |||
| oxygenated ACSF with 95% Oxygen/5%CO2 constantly being bubbled through the ACSF (ACSF; in mM 125 NaCl, 25 NaHCO3, 3 KCl, 1.25 NaH2PO4, 1 MgCl2, 2 CaCl2 and 25 Glucose). |
Referências
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