Culturing Rat Sympathetic Neurons from Embryonic Superior Cervical Ganglia for Morphological and Proteomic Analysis
Summary
Este artigo descreve o isolamento e a culminação de neurônios simpáticos de ratos embrionários da gânglio cervical superior. Também fornece protocolos detalhados para coloração imunocitoquímica e para preparação de extratos neuronais para análise espectrométrica em massa.
Abstract
Neurônios simpáticos da gânglio cervical superior de rato embrionário (SCG) têm sido usados como um sistema modelo in vitro para neurônios periféricos estudarem crescimento axonal, tráfico axonal, sinápgeno, crescimento dendrático, plasticidade dendrítica e interações de alvo nervoso em sistemas de cocultura. Este protocolo descreve o isolamento e dissociação de neurônios da gânglio cervical superior dos embriões de ratos E21, seguido pela preparação e manutenção de culturas neuronais puras em meio livre de soro. Como os neurônios não aderem ao plástico não revestido, os neurônios serão cultivados em tampas de vidro de 12 mm ou em placas de 6 poços revestidas com poli-D-lisina. Após o tratamento com um agente antimitotico (Ara-C, citose β-D-arabinofuranoside), este protocolo gera culturas neuronais saudáveis com menos de 5% de células não neuronais, que podem ser mantidas por mais de um mês in vitro. Embora os neurônios SCG de ratos embrionários sejam multipolares com dendritos de 5-8 in vivo; sob condições livres de soro, esses neurônios estendem apenas um único axônio na cultura e continuam a ser unipolares durante a duração da cultura. No entanto, esses neurônios podem ser induzidos a estender dendritos na presença de extrato de membrana do porão, proteínas morfogenéticas ósseas (BMPs), ou 10% de soro fetal da panturrilha. Essas culturas neuronais homogêneas podem ser utilizadas para coloração imunocitológica e para estudos bioquímicos. Este artigo também descreve o protocolo otimizado para coloração imunocitômica para microtúbulos associados à proteína-2 (MAP-2) nesses neurônios e para a preparação de extratos neuronais para espectrometria de massa.
Introduction
Neurônios simpáticos derivados de gânglios cervicais superiores embrionários (SCG) têm sido amplamente utilizados como um sistema de cultura neuronal primária para estudar muitos aspectos do desenvolvimento neuronal, incluindo a dependência do fator de crescimento, interações neurônio-alvo, sinalização neurotransmissor, crescimento axonal, desenvolvimento de dendrite e plasticidade, sinápsogênese e mecanismos de sinalização subjacentes às interações nervo-alvo/neurônio-glia1,,2,,3,,4,,5,,6,,7,,8,,9. Apesar de seu pequeno tamanho (cerca de 10000 neurônios/gânglios), existem três razões principais para o desenvolvimento e uso extensivo desse sistema cultural serem i) sendo o primeiro gânglio na cadeia simpática, eles são maiores e, portanto, mais fáceis de isolar, do que o resto da gânglio simpático10; ii) ao contrário dos neurônios centrais, os neurônios no SCG são bastante homogêneos com todos os neurônios sendo derivados da crista neural, tendo um tamanho semelhante, dependência do fator de crescimento nervoso e sendo nor-adrenérgico. Isso os torna um modelo valioso para estudos morfológicos e genômicos10,,11 e iii) esses neurônios podem ser mantidos em um meio definido sem soro contendo fator de crescimento nervoso por mais de um mês10,12. Os neurônios SCG perinatal têm sido amplamente utilizados para estudar os mecanismos subjacentes à iniciação e manutenção dos dendritos2. Isso ocorre principalmente porque, embora os neurônios SCG tenham uma extensa arbor ndrítica in vivo, eles não estendem dendritos in vitro na ausência de soro, mas podem ser induzidos a cultivar dendritos na presença de certos fatores de crescimento, como proteínas morfogenéticas ósseas2,,12,,13.
Este artigo descreve o protocolo para isolar e culminar neurônios SCG de ratos embrionários. Nos últimos 50 anos, as culturas neuronais primárias do SCG têm sido utilizadas principalmente para estudos morfológicos com um número limitado de estudos examinando as mudanças genômicas ou proteômicas em larga escala. Isso se deve principalmente ao pequeno tamanho do tecido, resultando no isolamento de baixas quantidades de DNA ou proteína, o que dificulta a realização de análises genômicas e proteômicas nesses neurônios. No entanto, nos últimos anos, o aumento da sensibilidade à detecção permitiu o desenvolvimento de métodos para examinar o genoma, o miRNome e o proteome nos neurônios SCG durante o desenvolvimento do crescimento dendrítico14,,15,,16,17. Este artigo também descreverá o método de análise morfológica desses neurônios usando a imunocitoquímica e um protocolo para obter extratos de proteína neuronal para análise espectrométrica de massa.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este artigo descreve os protocolos para cultivar neurônios simpáticos de gânglios cervicais superiores de filhotes de ratos embrionários. As vantagens de utilizar esse sistema modelo são que é possível obter uma população homogênea de neurônios fornecendo uma resposta semelhante aos fatores de crescimento, e como os requisitos do fator de crescimento para esses neurônios têm sido bem caracterizados, é possível cultivar esses neurônios in vitro em meios definidos, sob condições livres de soro<sup class="…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo Fundo de Desenvolvimento da Faculdade e pelo Programa de Pesquisa de Verão do Saint Mary’s College of California. Os autores também gostariam de agradecer à Dra. Os autores também gostariam de agradecer Haley Nelson no Escritório de Comunicações Universitárias do Saint Mary’s College of California por sua ajuda na produção e edição de vídeo.
Materials
| 2D nanoACQUITY | Waters Corporation | ||
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| BMP-7 | R&D Systems | 354-BP | |
| Bovine Serum Alumin | Sigma-Aldrich | 5470 | |
| Cell scraper | Corning | CLS-3010 | |
| Collagenase | Worthington Biochemical | 4176 | |
| Corning Costar or Nunc Flat bottomed Cell culture plates | Fisher Scientific | 07-200, 140675, 142475 | |
| Cytosine- β- D-arabinofuranoside | Sigma-Aldrich | C1768 | |
| D-phosphate buffered saline (Calcium and magnesium free) | ATCC | 30-2200 | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | |
| Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 15230 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| DMEM – Low glucose + Glutamine, + sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11885 | |
| Fatty Acid Free BSA | Calbiochem | 126609 | 20 mg/mL stock in low glucose DMEM |
| Fine forceps Dumont no.4 and no.5 | Ted Pella Inc | 5621, 5622 | |
| Forceps and Scissors for Dissection | Ted Pella Inc | 1328, 1329, 5002 | |
| Glass coverlips – 12mm | Neuvitro Corporation | GG-12 | |
| Goat-Anti Mouse IgG Alexa 488 conjugated | Thermo Fisher Scientific | A32723 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Thermo Fisher Scientific | 11765 | |
| Hank's balanced salt soltion (Calcium and Magnesium free) | Thermo Fisher Scientific | 14185 | |
| Insulin-Selenium-Transferrin (100X) | Thermo Fisher Scientific | 41400-045 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | A3221 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030 | |
| Leibovitz L-15 medium | Thermo Fisher Scientific | 11415064 | |
| Mounting media for glass coverslips | Thermo Fisher Scientific | P36931, P36934 | |
| Mouse-anti- MAP2 antibody (SMI-52) | BioLegend | SMI 52 | |
| Nerve growth factor | Envigo Bioproducts (formerly Harlan Bioproducts) | BT5017 | Stock 125 μg/mL in 0.2% Prionex in DMEM |
| Paraformaldehye | Spectrum Chemicals | P1010 | |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15140 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| Prionex | Millipore | 529600 | 10% solution, 100 mL |
| RapiGest SF | Waters Corporation | 186001861 | 5 X 1 mg |
| Synapt G2 High Definition Mass Spectrometry | Waters Corporation | ||
| Trifluoro acetic acid – Sequencing grade | Thermo Fisher Scientific | 28904 | 10 X 1 mL |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Trypsin | Promega or NEB | V511A, P8101S | 100 μg or 5 X 20 mg |
| Waters Total recovery vials | Waters Corporation | 186000385c |
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