Культивирование Крыса Симпатические нейроны из эмбрионального высшего шейного ganglia для морфологического и протеомного анализа
Summary
В этой статье описывается изоляция и культивирование эмбриональных крыс симпатической нейронов от высшего ганглиев шейки матки. Он также предоставляет подробные протоколы для иммуноцитохимического окрашивания и для подготовки нейрональных экстрактов для масс-спектрометрического анализа.
Abstract
Симпатические нейроны из эмбриональной крысы выше цервикальных ганглиев (SCG) были использованы в качестве модели системы in vitro для периферических нейронов для изучения аксонального роста, аксонального оборота, синаптогенеза, дендритного роста, дендритной пластичности и нервно-целевого взаимодействия в системах совместной культуры. Этот протокол описывает изоляцию и диссоциацию нейронов от высших ганглиев шейки матки эмбрионов крысы E21, а затем подготовку и поддержание чистых нейронных культур в сыворотке свободной среде. Так как нейроны не придерживаются пластика без покрытия, нейроны будут культурированы либо на 12 мм стеклянных крышки или 6-хорошо пластин, покрытых поли-D-лизин. После лечения антимитотическим агентом (Ara-C, цитозин-D-арабинофуранозид), этот протокол генерирует здоровые нейронные культуры с менее чем 5% не-нейрональных клеток, которые могут поддерживаться в течение месяца в пробирке. Хотя эмбриональные нейроны SCG крысы являются многополярные с 5-8 дендритов в виво; в условиях, свободных от сыворотки, эти нейроны распространяются только на один аксон в культуре и продолжают быть однополярной в течение всего периода культуры. Тем не менее, эти нейроны могут быть вызваны продлить дендритов в присутствии экстракта мембраны подвала, кости морфогенетических белков (BMPs), или 10% плода икроножной сыворотки. Эти однородные нейронные культуры могут быть использованы для иммуноцитохимического окрашивания и для биохимических исследований. В этой статье также описывается оптимизированный протокол для иммуноцитохимического окрашивания микротрубочек, связанных с белком-2 (MAP-2) в этих нейронах и для подготовки нейрональных экстрактов для масс-спектрометрии.
Introduction
Симпатические нейроны, полученные из эмбриональных превосходных ганглиев шейки матки (SCG) широко используются в качестве основной системы нейронной культуры для изучения многих аспектов развития нейронов, включая зависимость фактора роста, нейронно-целевые взаимодействия, нейромедиатор сигнализации, аксональный рост, дендрит развития и пластичности, синаптогенез и сигнальныемеханизмы,лежащие в основе нервно-целевой / нейрон-глиивзаимодействий 1,2,3,4,5,6,7,8,9. Несмотря на их небольшой размер (около 10000 нейронов / ганглиев), Есть три основные причины для развития и широкого использования этой системы культуры я) является первым ганглиев в симпатической цепи, они больше, и, следовательно, легче изолировать, чем остальные симпатическойганглиев 10; ii) в отличие от центральных нейронов, нейроны в SCG довольно однородны со всеми нейронами, получаемыми из нервного гребня, имеющие аналогичный размер, зависимость от фактора роста нерва и быть ни-adrenergic. Это делает их ценной моделью для морфологическихи геномных исследований 10,,11 и iii) эти нейроны могут поддерживаться в определенной среде, свободной от сыворотки, содержащей фактор роста нервовв течение месяца 10,12. Перинатальные нейроны SCG широко используются для изучения механизмов, лежащих в основе инициации и поддержания дендритов2. Это главным образом потому, что, хотя SCG нейроны имеют обширные дендритные беседки in vivo, они не расширяют дендритов в пробирке в отсутствиесыворотки,но могут быть вызваны расти дендриты в присутствии определенных факторов роста, таких как кости морфогенетических белков2,12,13.
В этой статье описывается протокол для изоляции и культивирования эмбриональных нейронов SCG крыс. За последние 50 лет, первичные нейронные культуры из SCG были в основном использованы для морфологических исследований с ограниченным числом исследований изучения крупномасштабных геномных или протеомных изменений. Это в основном связано с небольшим размером ткани, что приводит к изоляции низкого количества ДНК или белка, что затрудняет проведение геномного и протеомного анализа этих нейронов. Тем не менее, в последние годы повышенная чувствительность обнаружения позволила разработать методы для изучения генома, miRNome и протеома в нейронах SCG во время дендритного развития роста14,,15,,16,17. Эта статья также будет описывать метод морфологического анализа этих нейронов с использованием иммуноцитохимии и протокол для получения экстрактов нейронального белка для масс-спектрометрического анализа.
Protocol
Representative Results
Discussion
Эта статья описывает протоколы для культивирования симпатических нейронов от превосходных ганглиев шейки матки эмбриональных щенков крыс. Преимущества использования этой модели системы в том, что можно получить однородную популяцию нейронов, обеспечивающих аналогичную реакцию на ф…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Фондом развития факультета и грантом Летней исследовательской программы в Колледже Святой Марии в Калифорнии. Авторы также хотели бы поблагодарить д-ра Памелу Лейн (Pamela Lein) из Калифорнийского университета в Дэвисе и д-ра Энтони Иавароне (Anthony Iavarone) из Калифорнийского университета в Беркли за их советы в ходе разработки этих протоколов. Авторы также хотели бы поблагодарить Хейли Нельсон в Управлении коммуникаций колледжа в колледже Сент-Мэри в Калифорнии за ее помощь в производстве видео и редактирования.
Materials
| 2D nanoACQUITY | Waters Corporation | ||
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| BMP-7 | R&D Systems | 354-BP | |
| Bovine Serum Alumin | Sigma-Aldrich | 5470 | |
| Cell scraper | Corning | CLS-3010 | |
| Collagenase | Worthington Biochemical | 4176 | |
| Corning Costar or Nunc Flat bottomed Cell culture plates | Fisher Scientific | 07-200, 140675, 142475 | |
| Cytosine- β- D-arabinofuranoside | Sigma-Aldrich | C1768 | |
| D-phosphate buffered saline (Calcium and magnesium free) | ATCC | 30-2200 | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | |
| Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 15230 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| DMEM – Low glucose + Glutamine, + sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11885 | |
| Fatty Acid Free BSA | Calbiochem | 126609 | 20 mg/mL stock in low glucose DMEM |
| Fine forceps Dumont no.4 and no.5 | Ted Pella Inc | 5621, 5622 | |
| Forceps and Scissors for Dissection | Ted Pella Inc | 1328, 1329, 5002 | |
| Glass coverlips – 12mm | Neuvitro Corporation | GG-12 | |
| Goat-Anti Mouse IgG Alexa 488 conjugated | Thermo Fisher Scientific | A32723 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Thermo Fisher Scientific | 11765 | |
| Hank's balanced salt soltion (Calcium and Magnesium free) | Thermo Fisher Scientific | 14185 | |
| Insulin-Selenium-Transferrin (100X) | Thermo Fisher Scientific | 41400-045 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | A3221 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030 | |
| Leibovitz L-15 medium | Thermo Fisher Scientific | 11415064 | |
| Mounting media for glass coverslips | Thermo Fisher Scientific | P36931, P36934 | |
| Mouse-anti- MAP2 antibody (SMI-52) | BioLegend | SMI 52 | |
| Nerve growth factor | Envigo Bioproducts (formerly Harlan Bioproducts) | BT5017 | Stock 125 μg/mL in 0.2% Prionex in DMEM |
| Paraformaldehye | Spectrum Chemicals | P1010 | |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15140 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| Prionex | Millipore | 529600 | 10% solution, 100 mL |
| RapiGest SF | Waters Corporation | 186001861 | 5 X 1 mg |
| Synapt G2 High Definition Mass Spectrometry | Waters Corporation | ||
| Trifluoro acetic acid – Sequencing grade | Thermo Fisher Scientific | 28904 | 10 X 1 mL |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Trypsin | Promega or NEB | V511A, P8101S | 100 μg or 5 X 20 mg |
| Waters Total recovery vials | Waters Corporation | 186000385c |
Referências
- Rees, R. P., Bunge, M. B., Bunge, R. P. Morphological Changes in the neuritic growth cone and target neuron during synaptic junction development in culture. Journal of Cell Biology. 9, (1976).
- Chandrasekaran, V., Lein, P. J. Regulation of Dendritogenesis in Sympathetic Neurons. Autonomic Nervous System. , (2018).
- Higgins, D., Burack, M., Lein, P., Banker, G. Mechanisms of neuronal polarity. Current Opinion in Neurobiology. 7 (5), 599-604 (1997).
- Lein, P., Guo, X., Hedges, A. M., Rueger, D., Johnson, M., Higgins, D. The effects of Extracellular Matrix And Osteogenic Protein-1 on the morphological differentiation of rat sympathetic neurons. International Journal of Developmental Neuroscience. 14 (3), 203-215 (1996).
- Kobayashi, M., Fujii, M., Kurihara, K., Matsuoka, I. Bone morphogenetic protein-2 and retinoic acid induce neurotrophin-3 responsiveness in developing rat sympathetic neurons. Molecular Brain Research. 53 (1-2), 206-217 (1998).
- Burnham, P., Louis, J. C., Magal, E., Varon, S. Effects of ciliary neurotrophic factor on the survival and response to nerve growth factor of cultured rat sympathetic neurons. Biologia do Desenvolvimento. 161 (1), 96-106 (1994).
- Hou, X. E., Li, J. Y., Dahlström, A. Clathrin light chain and synaptotagmin I in rat sympathetic neurons. Journal of the Autonomic Nervous System. 62 (1-2), 13-26 (1997).
- Harris, G. M., et al. Nerve Guidance by a Decellularized Fibroblast Extracellular Matrix. Matrix Biology. , 176-189 (2017).
- Wingerd, K. L., et al. α4 integrins and vascular cell adhesion molecule-1 play a role in sympathetic innervation of the heart. Journal of Neuroscience. 22 (24), 10772-10780 (2002).
- Higgins, D., Lein, P., Osterhout, D. J., Johnson, M., Banker, G., Goslin, K. Tissue culture of autonomic neurons. Culturing Nerve Cells. , 177-205 (1991).
- Lein, P., Johnson, M., Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. Osteogenic protein-1 induces dendritic growth in rat sympathetic neurons. Neuron. 15 (3), 597-605 (1995).
- Bruckenstein, D. A., Higgins, D. Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture. Biologia do Desenvolvimento. 128 (2), 337-348 (1988).
- Voyvodic, J. T. Development and regulation of dendrites in the rat superior cervical ganglion. The Journal of Neuroscience. 7 (3), 904-912 (1987).
- Garred, M. M., Wang, M. M., Guo, X., Harrington, C. A., Lein, P. J. Transcriptional Responses of Cultured Rat Sympathetic Neurons during BMP-7-Induced Dendritic Growth. PLoS ONE. 6 (7), 21754 (2011).
- Pravoverov, K., et al. MicroRNAs are Necessary for BMP-7-induced Dendritic Growth in Cultured Rat Sympathetic Neurons. Cellular and Molecular Neurobiology. 39 (7), 917-934 (2019).
- Natera-Naranjo, O., Aschrafi, A., Gioio, A. E., Kaplan, B. B. Identification and quantitative analyses of microRNAs located in the distal axons of sympathetic neurons. RNA (New York, N.Y.). 16 (8), 1516-1529 (2010).
- Aschrafi, A., et al. Angiotensin II mediates the axonal trafficking of tyrosine hydroxylase and dopamine β-hydroxylase mRNAs and enhances norepinephrine synthesis in primary sympathetic neurons. Journal of Neurochemistry. 150 (6), 666-677 (2019).
- Ghogha, A., Bruun, D. a., Lein, P. J. Inducing dendritic growth in cultured sympathetic neurons. Journal of Visualized Experiments. (61), 4-8 (2012).
- Caceres, A., Banker, G., Steward, O., Binder, L., Payne, M. MAP2 is localized to the dendrites of hippocampal neurons which develop in culture. Brain Research. 315 (2), 314-318 (1984).
- Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. Osteogenic protein-1 and related bone morphogenetic proteins regulate dendritic growth and the expression of microtubule-associated protein-2 in rat sympathetic neurons. Neuroscience Letters. 245 (3), 131-134 (1998).
- Mi, H., et al. PANTHER version 11: Expanded annotation data from Gene Ontology and Reactome pathways, and data analysis tool enhancements. Nucleic Acids Research. 45, 183-189 (2017).
- Chandrasekaran, V., et al. Retinoic acid regulates the morphological development of sympathetic neurons. Journal of Neurobiology. 42 (4), (2000).
- Courter, L. A., et al. BMP7-induced dendritic growth in sympathetic neurons requires p75 NTR signaling. Developmental Neurobiology. 76 (9), 1003-1013 (2016).
- Lein, P. J., Fryer, A. D., Higgins, D. Cell Culture: Autonomic and Enteric Neurons. Encyclopedia of Neuroscience. , 625-632 (2009).
- Neto, E., et al. Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In vitro Tools for Neurobiological Research. Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).
- Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Research Notes. 9 (1), 82 (2016).
- Conrad, R., Jablonka, S., Sczepan, T., Sendtner, M., Wiese, S., Klausmeyer, A. Lectin-based isolation and culture of mouse embryonic motoneurons. Journal of Visualized Experiments. (55), e3200 (2011).
- Takeuchi, A., et al. Microfabricated device for co-culture of sympathetic neuron and iPS-derived cardiomyocytes. Proceedings of the Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, EMBS. 2013, 3817-3820 (2013).
- Takeuchi, A., et al. Development of semi-separated co-culture system of sympathetic neuron and cardiomyocyte. Proceedings of the 31st Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society: Engineering the Future of Biomedicine, EMBC 2009. , 1832-1835 (2009).
- Chandrasekaran, V., Lea, C., Sosa, J. C., Higgins, D., Lein, P. J. Reactive oxygen species are involved in BMP-induced dendritic growth in cultured rat sympathetic neurons. Molecular and Cellular Neuroscience. 67, (2015).
- Kim, W. Y., et al. Statins decrease dendritic arborization in rat sympathetic neurons by blocking RhoA activation. Journal of Neurochemistry. 108 (4), 1057-1071 (2009).
- Dalby, B., et al. Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: Primary neurons, siRNA, and high-throughput applications. Methods. 33 (2), 95-103 (2004).
- Szpara, M. L., et al. Analysis of gene expression during neurite outgrowth and regeneration. BMC Neuroscience. 8 (1), 100 (2007).
- Pop, C., Mogosan, C., Loghin, F. Evaluation of rapigest efficacy for the digestion of proteins from cell cultures and heart tissue. Clujul Medical. 87 (4), 5 (2014).
- Vit, O., Petrak, J. Integral membrane proteins in proteomics. How to break open the black box. Journal of Proteomics. 153, 8-20 (2017).
