Culturing Rat Sympatiska nervceller från embryonala Superior Cervical Ganglier för morfologiska och proteomisk analys
Summary
Detta dokument beskriver isolering och odling av embryonala råtta sympatisk nervceller från den överlägsna livmoderhalscancer ganglier. Det ger också detaljerade protokoll för immunocytochemical färgning och för att förbereda neuronal extrakt för masspektrometrisk analys.
Abstract
Sympatisk nervceller från embryonala råtta överlägsen livmoderhalscancer ganglier (SCG) har använts som en in vitro-modell system för perifera nervceller att studera axonal tillväxt, axonal trafficking, synaptogenesis, dendritisk tillväxt, dendritisk plasticitet och nerv-mål interaktioner i co-kultur system. Detta protokoll beskriver isolering och dissociation av nervceller från den överlägsna massundersökning ganglier av E21 råtta embryon, följt av beredning och underhåll av rena neuronala kulturer i serum-fri medium. Eftersom nervceller inte följer obestruken plast, nervceller kommer att odlas på antingen 12 mm glas coverslips eller 6-brunnsplattor belagda med poly-D-lysin. Efter behandling med ett antimitotic-medel (Ara-C, cytosin β-D-arabinofuranoside), genererar detta protokoll friska neuronala kulturer med mindre än 5% icke-neuronala celler, som kan upprätthållas i över en månad in vitro. Även om embryonala råtta SCG nervceller är multipolär med 5-8 dendrites in vivo; under serumfria förhållanden sträcker sig dessa nervceller endast en enda axon i kulturen och fortsätter att vara unipolär under den tid som kulturen pågår. Dessa nervceller kan dock induceras att förlänga dendrites i närvaro av källaren membran extrakt, ben morphogenetic proteiner (BMPs), eller 10% fetala kalv serum. Dessa homogena neuronala kulturer kan användas för immunocytochemical färgning och för biokemiska studier. Detta papper beskriver också optimerat protokoll för immunocytochemical färgning för microtubule associerade protein-2 (MAP-2) i dessa nervceller och för utarbetandet av neuronal extrakt för masspektrometri.
Introduction
Sympatiska nervceller som härrör från embryonala överlägsen livmoderhalscancer ganglier (SCG) har använts i stor utsträckning som en primär neuronal kultur system för att studera många aspekter av neuronal utveckling inklusive tillväxtfaktor beroende, neuron-target interaktioner, signalsignalering av signalsubstanser, axonal tillväxt, dendritutveckling och plasticitet, synaptogenes och signalmekanismer underliggande nerv-target/neuron-glia interaktioner1,2,3,4,5,6,77,8,9. Trots deras lilla storlek (runt 10000 nervceller/ganglier), det finns tre huvudsakliga skäl för utveckling och omfattande användning av detta kultursystem är i) är den första ganglierna i den sympatiska kedjan, de är större, och därför lättare att isolera, än resten av de sympatiska ganglierna10; ii) till skillnad från centrala nervceller, nervceller i SCG är ganska homogen med alla nervceller som härrör från neurala krönet, med en liknande storlek, beroende av nervtillväxtfaktor och är inte heller adrenerga. Detta gör dem till en värdefull modell för morfologiska och genomiskastudier 10,11 och iii) dessa nervceller kan bibehållas i ett definierat serumfritt medium som innehåller nervtillväxtfaktor i över en månad10,12. Perinatala SCG nervceller har använts i stor utsträckning för att studera de mekanismer som ligger till grund för inledande och underhåll av dendrites2. Detta beror främst på, även om SCG nervceller har en omfattande dendritisk arbor in vivo, de inte förlänga dendriter in vitro i avsaknad av serum men kan induceras att växa dendriter i närvaro av vissa tillväxtfaktorer såsom ben morfogenetiska proteiner2,12,13.
Detta dokument beskriver protokollet för att isolera och culturing embryonala råtta SCG nervceller. Under de senaste 50 åren har primära neuronala kulturer från SCG främst använts för morfologiska studier med ett begränsat antal studier som undersöker de storskaliga genomiska eller proteomiska förändringarna. Detta beror främst på liten vävnadsstorlek som resulterar i isolering av låga mängder DNA eller protein, vilket gör det svårt att utföra genomiska och proteomiska analyser på dessa nervceller. Under senare år har dock ökad detektionskänslighet möjliggjort utveckling av metoder för att undersöka genomet, miRNom och proteom i SCG-neuronerna under dendritisk tillväxtutveckling14,15,16,17. Detta dokument kommer också att beskriva metoden för morfologisk analys av dessa nervceller med hjälp av immuncytokemi och ett protokoll för att erhålla neuronal protein extrakt för masspektrometrisk analys.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta papper beskriver protokollen för odling sympatisk nervceller från överlägsen livmoderhalscancer ganglier av embryonala råtta valpar. Fördelarna med att använda denna modell system är att det är möjligt att få en homogen population av nervceller ger ett liknande svar på tillväxtfaktorer, och eftersom tillväxtfaktorn kraven för dessa nervceller har varit väl -karakteriseras, är det möjligt att växa dessa nervceller in vitro i definierade medier, under serum-fria förhållanden10</…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av fakulteten utvecklingsfonden och Summer Research Program bidrag vid Saint Mary’s College of California. Författarna vill också tacka Dr Pamela Lein vid University of California i Davis och Dr Anthony Iavarone på UC Berkeley Mass spektrometri anläggning för deras råd under utvecklingen av dessa protokoll. Författarna vill också tacka Haley Nelson i Office of College Communications vid Saint Mary’s College of California för hennes hjälp med videoproduktion och redigering.
Materials
| 2D nanoACQUITY | Waters Corporation | ||
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| BMP-7 | R&D Systems | 354-BP | |
| Bovine Serum Alumin | Sigma-Aldrich | 5470 | |
| Cell scraper | Corning | CLS-3010 | |
| Collagenase | Worthington Biochemical | 4176 | |
| Corning Costar or Nunc Flat bottomed Cell culture plates | Fisher Scientific | 07-200, 140675, 142475 | |
| Cytosine- β- D-arabinofuranoside | Sigma-Aldrich | C1768 | |
| D-phosphate buffered saline (Calcium and magnesium free) | ATCC | 30-2200 | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | |
| Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 15230 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| DMEM – Low glucose + Glutamine, + sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11885 | |
| Fatty Acid Free BSA | Calbiochem | 126609 | 20 mg/mL stock in low glucose DMEM |
| Fine forceps Dumont no.4 and no.5 | Ted Pella Inc | 5621, 5622 | |
| Forceps and Scissors for Dissection | Ted Pella Inc | 1328, 1329, 5002 | |
| Glass coverlips – 12mm | Neuvitro Corporation | GG-12 | |
| Goat-Anti Mouse IgG Alexa 488 conjugated | Thermo Fisher Scientific | A32723 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Thermo Fisher Scientific | 11765 | |
| Hank's balanced salt soltion (Calcium and Magnesium free) | Thermo Fisher Scientific | 14185 | |
| Insulin-Selenium-Transferrin (100X) | Thermo Fisher Scientific | 41400-045 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | A3221 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030 | |
| Leibovitz L-15 medium | Thermo Fisher Scientific | 11415064 | |
| Mounting media for glass coverslips | Thermo Fisher Scientific | P36931, P36934 | |
| Mouse-anti- MAP2 antibody (SMI-52) | BioLegend | SMI 52 | |
| Nerve growth factor | Envigo Bioproducts (formerly Harlan Bioproducts) | BT5017 | Stock 125 μg/mL in 0.2% Prionex in DMEM |
| Paraformaldehye | Spectrum Chemicals | P1010 | |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15140 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| Prionex | Millipore | 529600 | 10% solution, 100 mL |
| RapiGest SF | Waters Corporation | 186001861 | 5 X 1 mg |
| Synapt G2 High Definition Mass Spectrometry | Waters Corporation | ||
| Trifluoro acetic acid – Sequencing grade | Thermo Fisher Scientific | 28904 | 10 X 1 mL |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Trypsin | Promega or NEB | V511A, P8101S | 100 μg or 5 X 20 mg |
| Waters Total recovery vials | Waters Corporation | 186000385c |
Referências
- Rees, R. P., Bunge, M. B., Bunge, R. P. Morphological Changes in the neuritic growth cone and target neuron during synaptic junction development in culture. Journal of Cell Biology. 9, (1976).
- Chandrasekaran, V., Lein, P. J. Regulation of Dendritogenesis in Sympathetic Neurons. Autonomic Nervous System. , (2018).
- Higgins, D., Burack, M., Lein, P., Banker, G. Mechanisms of neuronal polarity. Current Opinion in Neurobiology. 7 (5), 599-604 (1997).
- Lein, P., Guo, X., Hedges, A. M., Rueger, D., Johnson, M., Higgins, D. The effects of Extracellular Matrix And Osteogenic Protein-1 on the morphological differentiation of rat sympathetic neurons. International Journal of Developmental Neuroscience. 14 (3), 203-215 (1996).
- Kobayashi, M., Fujii, M., Kurihara, K., Matsuoka, I. Bone morphogenetic protein-2 and retinoic acid induce neurotrophin-3 responsiveness in developing rat sympathetic neurons. Molecular Brain Research. 53 (1-2), 206-217 (1998).
- Burnham, P., Louis, J. C., Magal, E., Varon, S. Effects of ciliary neurotrophic factor on the survival and response to nerve growth factor of cultured rat sympathetic neurons. Biologia do Desenvolvimento. 161 (1), 96-106 (1994).
- Hou, X. E., Li, J. Y., Dahlström, A. Clathrin light chain and synaptotagmin I in rat sympathetic neurons. Journal of the Autonomic Nervous System. 62 (1-2), 13-26 (1997).
- Harris, G. M., et al. Nerve Guidance by a Decellularized Fibroblast Extracellular Matrix. Matrix Biology. , 176-189 (2017).
- Wingerd, K. L., et al. α4 integrins and vascular cell adhesion molecule-1 play a role in sympathetic innervation of the heart. Journal of Neuroscience. 22 (24), 10772-10780 (2002).
- Higgins, D., Lein, P., Osterhout, D. J., Johnson, M., Banker, G., Goslin, K. Tissue culture of autonomic neurons. Culturing Nerve Cells. , 177-205 (1991).
- Lein, P., Johnson, M., Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. Osteogenic protein-1 induces dendritic growth in rat sympathetic neurons. Neuron. 15 (3), 597-605 (1995).
- Bruckenstein, D. A., Higgins, D. Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture. Biologia do Desenvolvimento. 128 (2), 337-348 (1988).
- Voyvodic, J. T. Development and regulation of dendrites in the rat superior cervical ganglion. The Journal of Neuroscience. 7 (3), 904-912 (1987).
- Garred, M. M., Wang, M. M., Guo, X., Harrington, C. A., Lein, P. J. Transcriptional Responses of Cultured Rat Sympathetic Neurons during BMP-7-Induced Dendritic Growth. PLoS ONE. 6 (7), 21754 (2011).
- Pravoverov, K., et al. MicroRNAs are Necessary for BMP-7-induced Dendritic Growth in Cultured Rat Sympathetic Neurons. Cellular and Molecular Neurobiology. 39 (7), 917-934 (2019).
- Natera-Naranjo, O., Aschrafi, A., Gioio, A. E., Kaplan, B. B. Identification and quantitative analyses of microRNAs located in the distal axons of sympathetic neurons. RNA (New York, N.Y.). 16 (8), 1516-1529 (2010).
- Aschrafi, A., et al. Angiotensin II mediates the axonal trafficking of tyrosine hydroxylase and dopamine β-hydroxylase mRNAs and enhances norepinephrine synthesis in primary sympathetic neurons. Journal of Neurochemistry. 150 (6), 666-677 (2019).
- Ghogha, A., Bruun, D. a., Lein, P. J. Inducing dendritic growth in cultured sympathetic neurons. Journal of Visualized Experiments. (61), 4-8 (2012).
- Caceres, A., Banker, G., Steward, O., Binder, L., Payne, M. MAP2 is localized to the dendrites of hippocampal neurons which develop in culture. Brain Research. 315 (2), 314-318 (1984).
- Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. Osteogenic protein-1 and related bone morphogenetic proteins regulate dendritic growth and the expression of microtubule-associated protein-2 in rat sympathetic neurons. Neuroscience Letters. 245 (3), 131-134 (1998).
- Mi, H., et al. PANTHER version 11: Expanded annotation data from Gene Ontology and Reactome pathways, and data analysis tool enhancements. Nucleic Acids Research. 45, 183-189 (2017).
- Chandrasekaran, V., et al. Retinoic acid regulates the morphological development of sympathetic neurons. Journal of Neurobiology. 42 (4), (2000).
- Courter, L. A., et al. BMP7-induced dendritic growth in sympathetic neurons requires p75 NTR signaling. Developmental Neurobiology. 76 (9), 1003-1013 (2016).
- Lein, P. J., Fryer, A. D., Higgins, D. Cell Culture: Autonomic and Enteric Neurons. Encyclopedia of Neuroscience. , 625-632 (2009).
- Neto, E., et al. Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In vitro Tools for Neurobiological Research. Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).
- Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Research Notes. 9 (1), 82 (2016).
- Conrad, R., Jablonka, S., Sczepan, T., Sendtner, M., Wiese, S., Klausmeyer, A. Lectin-based isolation and culture of mouse embryonic motoneurons. Journal of Visualized Experiments. (55), e3200 (2011).
- Takeuchi, A., et al. Microfabricated device for co-culture of sympathetic neuron and iPS-derived cardiomyocytes. Proceedings of the Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, EMBS. 2013, 3817-3820 (2013).
- Takeuchi, A., et al. Development of semi-separated co-culture system of sympathetic neuron and cardiomyocyte. Proceedings of the 31st Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society: Engineering the Future of Biomedicine, EMBC 2009. , 1832-1835 (2009).
- Chandrasekaran, V., Lea, C., Sosa, J. C., Higgins, D., Lein, P. J. Reactive oxygen species are involved in BMP-induced dendritic growth in cultured rat sympathetic neurons. Molecular and Cellular Neuroscience. 67, (2015).
- Kim, W. Y., et al. Statins decrease dendritic arborization in rat sympathetic neurons by blocking RhoA activation. Journal of Neurochemistry. 108 (4), 1057-1071 (2009).
- Dalby, B., et al. Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: Primary neurons, siRNA, and high-throughput applications. Methods. 33 (2), 95-103 (2004).
- Szpara, M. L., et al. Analysis of gene expression during neurite outgrowth and regeneration. BMC Neuroscience. 8 (1), 100 (2007).
- Pop, C., Mogosan, C., Loghin, F. Evaluation of rapigest efficacy for the digestion of proteins from cell cultures and heart tissue. Clujul Medical. 87 (4), 5 (2014).
- Vit, O., Petrak, J. Integral membrane proteins in proteomics. How to break open the black box. Journal of Proteomics. 153, 8-20 (2017).
