Kolorektal Kanser Hücrelerinin Üç Boyutlu Küresel Kültürlerinde Probiyotiklerin Hücresiz Süpernatantı Kullanılarak Hücre Ölümünün Değerlendirilmesi
Summary
Burada Lactobacillus hücresiz süpernatantın (LCFS) kanser önleyici etkilerini anlamak için yöntemler sunulmaktadır. Kolorektal kanser hücre hatları 3D kültürlerde LCFS ile tedavi edildiğinde hücre ölümlerini göstermektedir. Sferoid üretme süreci iskeleye bağlı olarak optimize edilebilir ve sunulan analiz yöntemleri ilgili sinyal yollarını değerlendirmek için yararlıdır.
Abstract
Bu makale, probiyotikkültürü olarak kabul edilen Lactobacillus fermentum hücre kültüründen süpernatantlar kullanarak çok hücreli kanser hücrelerinin üç boyutlu (3D) sferoidlerinde kanser hücresi ölümlerini değerlendirmek için bir protokol açıklanmaktadır. Lactobacillus hücresiz süpernatant (LCFS) test etmek için 3D kültürlerin kullanımı, özellikle L. fermentum bağırsak içinde kanser önleyici etkiler üretebileceğinden, 2D monolayerlerde test etmekten daha iyi bir seçenektir. L. fermentum supernatant’ın 3D kültür koşullarında çeşitli kolorektal kanser (CRC) hücrelerine karşı artan anti-proliferatif etkilere sahip olduğu belirlendi. İlginçtir ki, bu etkiler L. fermentum’un kanser hücre ölümünü teşvik etmedeki önemli yeteneğini gösteren kültür modeliyle güçlü bir şekilde ilişkiliydi. Aşağıda sunulan protokol kullanılarak çeşitli CRC’lerden (kolorektal kanser hücreleri) stabil sferoidler üretilmiştir. 3D küresel oluşturmanın bu protokolü zaman tasarrufu sağlar ve uygun maliyetlidir. Bu sistem, LCFS’nin birden fazla CRC sferoid türündeki kanser önleyici etkilerini kolayca araştırmak için geliştirilmiştir. Beklendiği gibi, deney sırasında LCFS ile tedavi edilen CRC sferoidleri hücre ölümünü güçlü bir şekilde indükledi ve qRT-PCR, batı şişkinliği ve FACS analizi ile analiz edildiği gibi spesifik apoptoz moleküler belirteçlerini ifade etti. Bu nedenle, bu yöntem hücre canlılığını keşfetmek ve anti-kanser ilaçlarının etkinliğini değerlendirmek için değerlidir.
Introduction
Probiyotikler, bağışıklık homeostazını geliştiren ve enerji metabolizmasını barındıran bağırsaktaki en avantajlı mikroorganizmalardır1. Lactobacillus ve Bifidobacterium probiyotikleri bağırsakta bulunan türünün en gelişmişidir2,3. Önceki araştırmalar Lactobacillus’un kolorektal kanser de dahil olmak üzere çeşitli kanserler üzerinde inhibitör ve antiproliferatif etkileri olduğunu göstermiştir4. Ayrıca, probiyotikler enflamatuar bağırsak hastalıklarını, Crohn hastalığını ve ülseratif koliti önler5,6. Bununla birlikte, probiyotiklerle yapılan çalışmaların çoğu katı yüzeylerde yetişen iki boyutlu (2D) monolayerlerde gerçekleştirildi.
Yapay kültür sistemleri, kanser hücreleri için doğal olmayan çevresel özelliklerden yoksundur. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için üç boyutlu (3D) kültür sistemleri geliştirilmiştir7,8. 3D kanser hücreleri hücre canlılığı, çoğalma, morfoloji, hücre-hücre iletişimi, ilaç duyarlılığı ve in vivo alaka düzeyi9,10gibi temel biyolojik mekanizmalar açısından iyileşmeler göstermektedir. Ayrıca, sferoidler çok hücreli kolorektal kanser türlerinden yapılır ve hücre-hücre etkileşimlerine ve hücre dışı matrise (ECM)bağlıdır 11. Önceki çalışmamız, Lactobacillus fermentum kullanılarak üretilen probiyotik hücresiz süpernatantın (CFS) kolorektal kanser (CRC) hücrelerinin 3D kültürleri üzerinde kanser önleyici etkiler gösterdiğini bildirmiştir12. CFS’nin probiyotik etkilerini 3D sferoidler üzerinde test etmek için uygun bir alternatif strateji olduğunu önerdik12.
Burada, probiyotik hücresiz süpernatantın (CFS) çeşitli 3D kolorektal kanser taklit sistemleri üzerindeki terapötik etkilerinin analizi için çok hücreli 3D kolorektal kanser türlerini barındırabilecek bir yaklaşım sunuyoruz. Bu yöntem, ilgili probiyotik ve anti-kanser etkilerinin in vitro analizi için bir araç sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Komşu hücreler ve hücre dışı matris (ECM) de dahil olmak üzere doku mikroçevrasyonu doku üretimi için temeldir ve hücre büyümesi ve doku gelişiminin kontrolünde çok önemlidir13. Bununla birlikte, 2D kültürlerin hücresel etkileşimlerin bozulması, hücre morfolojisindeki değişiklikler, hücre dışı ortamlar ve bölüm14yaklaşımı gibi çeşitli dezavantajları vardır. 3D hücre kültürü sistemleri in vivo etkileri daha iyi üretmek için titizli…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma, Kore Standartlar ve Bilim Araştırma Enstitüsü tarafından finanse edilen “Kimya ve Radyasyon için ölçüm standartlarının oluşturulması”, KRISS-2020-GP2020-0003 hibe numarası ve “Biyomalzemeler ve Tıbbi Yakınsama için Ölçüm Standartlarının ve Teknolojisinin Geliştirilmesi”, KRISS-2020-GP2020-0004 programlarının hibe numarası ile desteklenmiştir. Bu araştırma bilim ve Bİt Bakanlığı (MSIT), Kore Ulusal Araştırma Vakfı (NRF-2019M3A9F3065868), Sağlık ve Refah Bakanlığı (MOHW), Kore Sağlık Endüstrisi Geliştirme Enstitüsü (KHIDI, HI20C0558), Ticaret, Sanayi ve Enerji Bakanlığı (MOTIE) ve Kore Sanayi Teknolojisi Değerlendirme Enstitüsü (KEIT, 20009350) tarafından da desteklendi. ORCID Kimliği (Hee Min Yoo: 0000-0002-5951-2137; Dukjin Kang: 0000-0002-5924-9674; Seil Kim: 0000-0003-3465-7118; Joo-Eun Lee: 0000-0002-2495-1439; Jina Lee: 0000-0002-3661-3701). Deneylere yardım için Chang Woo Park’a teşekkür ederiz.
Materials
10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 15-well, 15 µl |
Biorad | 4561036 | Pkg of 10 |
| Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | 100 covers |
| 10x transfer buffer | Intron | IBS-BT031A | 1 L |
| 10X Tris-Glycine (W/SDS) | Intron | IBS-BT014 | 1 L |
| Axygen 2.0 mL MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube, Polypropylene, Clear, Nonsterile, 500 Tubes/Pack, 10 Packs/Case | Corning | SCT-200-C | 500 Tubes/Pack, 10 Packs/Case |
| BD Difco Bacto Agar | BD | 214010 | 500 g |
| BD Difco Lactobacilli MRS Broth | BD | DF0881-17-5 | 500 g |
| CellTiter-Glo 3D Cell viability assay | Promega | G9681 | 100μl/assay in 96-well plates |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 11697498001 | vial of 20 tablets |
| Corning Phosphate-Buffered Saline, 1X without calcium and magnesium, PH 7.4 ± 0.1 | Corning | 21-040-CV | 500 mL |
| EMD Millipore Immobilon-P PVDF Transfer Membranes | fisher Scientific | IPVH00010 | 26.5cm x 3.75m roll; Pore Size: 0.45um |
| Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | 25/Pack, 500/Case |
| Fetal Bovine Serum, certified, US origin | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | 500 mL |
| iScript cDNA Synthesis Kit, 25 x 20 µl rxns #1708890 | Biorad | 1708890 | 25 x 20 µL rxns |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Biorad | 1725121 | 5 x 1 mL |
| Lactobacillus fermentum | Korean Collection for Type Cultures | KCTC 3112 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | C6852-25G | 25 g |
| Methyl Cellulose (3500-5600mPa·s, 2% in Water at 20°C) | TCI | M0185 | 500 g |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 mL | Applied Biosystems | 4346906 | 20 plates |
| Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 µm, mixed cellulose esters, 33 mm, ethylene oxide sterilized | Millipore | SLGS033SB | 250 |
| PE Annexin V Apoptosis Detection Kit with 7-AAD | Biolegend | 640934 | 100 tests |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 100 mL |
| Propidium Iodide | Introgen | P1304MP | 100 mg |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | Thermo Fisher Scientific | 89901 | 250 mL |
| RNeasy Mini Kit (250) | Qiagen | 74106 | 250 |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-119 | 500 mL |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | 100 mL |
| Name of Materials/Equipment/Software | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| anti – p-IκBα (B-9) | Santa cruze | sc-8404 | 200 µg/mL |
| anti-BclxL (H-5) | Santa cruze | sc-8392 | 200 µg/mL |
| anti-PARP 1 (C2-10) | Santa cruze | sc-53643 | 50 µl ascites |
| anti-β-actin (C4) | Santa cruze | sc-47778 | 200 µg/mL |
| BD FACSVerse | BD Biosciences | San Diego, CA, USA | |
| Synergy HTX Multi-Mode Microplate Reader | BioT | S1LFA | |
| CO2 incubator | Thermo fisher | HERAcell 150i | |
| Conical tube 15 ml | SPL | 50015 | |
| Conical tube 50 ml | SPL | 50050 | |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Sigma-Aldrich | CLS7007 | |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Sigma-Aldrich | CLS3471 | |
| Costar 50 mL Reagent Reservoirs, 5/Bag, Sterile | Costar | 4870 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermofisher | C10228 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | invitrogen | AMQAF1000 | |
| EnSpire Multimode Reader | Perkin Elmer | Enspire 2300 | |
| Eppendorf Research Plus Multi Channel Pipette, 8-channel | Eppendorf | 3122000051 | |
| FlowJo software | TreeStar | Ashland, OR, USA | |
| Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson immunoresearch | 115-035-062 | 1.5 mL |
| Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson immunoresearch | 111-035-144 | 2.0 mL |
| GraphPad Prism 5 | GraphPad Software | Inc., San Diego, CA, USA | |
| ImageJ | NIH | ||
| ImageQuant LAS 4000 mini | Fujifilm | Tokyo, Japan | |
| Incubated shaker | Lab companion | SIF-6000R | |
| Multi Gauge Ver. 3.0, | Fujifilm | Tokyo, Japan | |
| Optical density (OD)LAMBDA UV/Vis Spectrophotometers | Perkin Elmer | Waltham, MA, USA | |
| Phase-contrast microscope | Olympus | Tokyo, Japan | |
| SPL microcentrifuge tube 1.5mL | SPL | 60015 | |
| SPL Multi Channel Reservoirs, 12-Chs, PS, Sterile | SPL | 21012 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | Waltham, MA, USA | |
| Vibra-Cell Ultrasonic Liquid Processors | SONICS-vibra cell | VC 505 | 500 Watt ultrasonic processor |
| Vinyl Anaerobic Chamber | COY LAB PRODUCTS |
Referências
- Bron, P. A., Van Baarlen, P., Kleerebezem, M. Emerging molecular insights into the interaction between probiotics and the host intestinal mucosa. Nature Reviews Microbiology. 10 (1), 66-78 (2012).
- Ruiz, L., Delgado, S., Ruas-Madiedo, P., Sánchez, B., Margolles, A. Bifidobacteria and their molecular communication with the immune system. Frontiers in Microbiology. 8, 1-9 (2017).
- Sanders, M. E., Merenstein, D. J., Reid, G., Gibson, G. R., Rastall, R. A. Probiotics and prebiotics in intestinal health and disease: from biology to the clinic. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. 16 (10), 605-616 (2019).
- Pandey, K. R., Naik, S. R., Vakil, B. V. Probiotics, prebiotics and synbiotics- a review. Journal of Food Science and Technology. 52 (12), 7577-7587 (2015).
- Harish, K., Varghese, T. Probiotics in humans-evidence based review. Calicut Medical Journal. 4 (4), 3 (2006).
- Routy, B., et al. The gut microbiota influences anticancer immunosurveillance and general health. Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (6), 382-396 (2018).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. Most of the cell-based data-harvesting efforts that drive the integration of cell biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
- Jong, B. K. Three-dimensional tissue culture models in cancer biology. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 365-377 (2005).
- Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Scientific Reports. 6, 19103 (2016).
- Anton, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. Three-dimensional cell culture: A breakthrough in vivo. International Journal of Molecular Sciences. 16 (3), 5517-5527 (2015).
- Lee, J. E., et al. Characterization of the Anti-Cancer Activity of the Probiotic Bacterium Lactobacillus fermentum Using 2D vs. 3D Culture in Colorectal Cancer Cells. Biomolecules. 9 (10), 557 (2019).
- Koledova, Z. 3D cell culture: An introduction. Methods in Molecular Biology. 1612, (2017).
- Kapałczyńska, M., et al. 2D and 3D cell cultures – a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
- Langhans, S. A. Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning. Frontiers in Pharmacology. 9, 1-14 (2018).
- Breslin, S., O’Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: The missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
- Mazzocchi, A. R., Rajan, S. A. P., Votanopoulos, K. I., Hall, A. R., Skardal, A. In vitro patient-derived 3D mesothelioma tumor organoids facilitate patient-centric therapeutic screening. Scientific Reports. 8, 2886 (2018).
- Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery. Oncology Letters. 14 (6), 6999-7010 (2017).
- Thirumala, S., Gimble, J., Devireddy, R. Methylcellulose Based Thermally Reversible Hydrogel System for Tissue Engineering Applications. Cells. 2 (3), 460-475 (2013).
- Chandrashekran, A., et al. Methylcellulose as a scaffold in the culture of liver-organoids for the potential of treating acute liver failure. Cell and Gene Therapy Insights. 4 (11), 1087-1103 (2018).
- Lee, W., Park, J. 3D patterned stem cell differentiation using thermo-responsive methylcellulose hydrogel molds. Scientific Reports. 6, 1-11 (2016).
- Fan, H., Demirci, U., Chen, P. Emerging organoid models: Leaping forward in cancer research. Journal of Hematology and Oncology. 12 (1), 1-10 (2019).
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
- Liou, C. S., et al. A Metabolic Pathway for Activation of Dietary Glucosinolates by a Human Gut Symbiont. Cell. 180 (4), 717-728 (2020).
- Sherwin, E., Bordenstein, S. R., Quinn, J. L., Dinan, T. G., Cryan, J. F. Microbiota and the social brain. Science. 366 (6465), 2016 (2019).
- Honda, K., Littman, D. R. The microbiota in adaptive immune homeostasis and disease. Nature. 535 (7610), 75-84 (2016).
- Bárcena, C., et al. Healthspan and lifespan extension by fecal microbiota transplantation into progeroid mice. Nature Medicine. 25 (8), 1234-1242 (2019).
- Michalovich, D., et al. Obesity and disease severity magnify disturbed microbiome-immune interactions in asthma patients. Nature Communications. 10, 5711 (2019).
- Ansaldo, E., et al. Akkermansia muciniphila induces intestinal adaptive immune responses during homeostasis. Science. 364 (6446), 1179-1184 (2019).
