Utvärdera celldöd med hjälp av cellfri supernatant av probiotika i tredimensionella sfäroidkulturer av kolorektalcancerceller
Summary
Här presenteras metoder för att förstå anti-cancer effekter av Lactobacillus cell-free supernatant (LCFS). Kolorektal cancer cellinjer visar celldöd när behandlas med LCFS i 3D kulturer. Processen att generera sfäroider kan optimeras beroende på byggnadsställningen och de analysmetoder som presenteras är användbara för att utvärdera de involverade signalvägarna.
Abstract
Detta manuskript beskriver ett protokoll för att utvärdera cancercellsdödsfall i tredimensionella (3D) sfäroider av multicellulära typer av cancerceller med hjälp av supernatanter från Lactobacillus fermentumcellkultur , som betraktas som probiotikakulturer. Användningen av 3D-kulturer för att testa Lactobacillus cellfria supernatant (LCFS) är ett bättre alternativ än att testa i 2D-monoskikt, särskilt som L. fermentum kan producera anti-cancereffekter i tarmen. L. fermentum supernatant identifierades att ha ökade anti-proliferative effekter mot flera kolorektal cancer (CRC) celler i 3D kultur villkor. Intressant nog var dessa effekter starkt relaterade till kulturmodellen, vilket visar den anmärkningsvärda förmågan hos L. fermentum att inducera cancercelldöd. Stabila sfäroider genererades från olika CRCs (kolorektal cancerceller) med hjälp av protokollet som presenteras nedan. Detta protokoll för att generera 3D-sfäroid är tidsbesparande och kostnadseffektivt. Detta system utvecklades för att enkelt undersöka anti-cancer effekter av LCFS i flera typer av CRC sfäroider. Som förväntat inducerade CRC sfäroider med LCFS starkt celldöd under experimentet och uttryckte specifika apoptos molekylära markörer som analyseras av qRT-PCR, western blotting och FACS analys. Därför är denna metod värdefull för att utforska cellens livskraft och utvärdera effekten av anti-cancerläkemedel.
Introduction
Probiotika är de mest fördelaktiga mikroorganismerna i tarmen som förbättrar immunhomeostas och värdenergimetabolism1. Probiotika från Lactobacillus och Bifidobacterium är de mest avancerade i sitt slag som finns i tarmarna2,3. Tidigare undersökningar har visat att Lactobacillus har hämmande och antiproliferativa effekter på flera cancerformer, inklusive kolorektal cancer4. Dessutom förhindrar probiotika inflammatoriska tarmsjukdomar, Crohns sjukdom och ulcerös kolit5,6. De flesta studier med probiotika utfördes dock i tvådimensionella (2D) monoskikt som odlas på fasta ytor.
Artificiella odlingssystem saknar miljöegenskaper, vilket inte är naturligt för cancerceller. För att övervinna denna begränsning har tredimensionella (3D) odlingssystem utvecklats7,8. Cancerceller i 3D visar förbättringar när det gäller grundläggande biologiska mekanismer, såsom cell livskraft, spridning, morfologi, cellcellskommunikation, läkemedelskänslighet och in vivo relevans9,10. Dessutom är sfäroider gjorda av multicellulära typer av kolorektal cancer och är beroende av cellcellsinteraktioner och den extracellulära matrisen (ECM)11. Vår tidigare studie har rapporterat att probiotiska cellfria supernatant (CFS) som produceras med Lactobacillus fermentum visade anti-cancer effekter på 3D kulturer av kolorektal cancer (CRC) celler12. Vi föreslog att CFS är en lämplig alternativ strategi för att testa probiotiska effekter på 3D-sfäroider12.
Här presenterar vi ett tillvägagångssätt som kan rymma multicellulära typer av 3D-kolorektal cancer för analys av terapeutiska effekter av probiotiskt cellfritt supernatant (CFS) på flera 3D-kolorektal cancer mimicry system. Denna metod ger ett sätt att analysera relaterade probiotiska och anti-cancer effekter in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vävnadsmikromiljön, inklusive närliggande celler och den extracellulära matrisen (ECM), är grundläggande för vävnadsgenerering och avgörande för kontrollen av celltillväxt och vävnadsutveckling13. 2D-kulturer har dock flera nackdelar, såsom störningar i cellinteraktioner, liksom förändringar i cellmorfologi, extracellulära miljöer och tillvägagångssättet i division14. 3D-cellkultursystem har studerats noggrant för att bättre reproducera in vivo-effekt…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning stöddes av “Etablering av mätstandarder för kemi och strålning”, bidragsnummer KRISS-2020-GP2020-0003 och “Utveckling av mätstandarder och teknik för biomaterial och medicinsk konvergens”, bidragsnummer KRISS-2020-GP2020-0004-program, finansierade av Korea Research Institute of Standards and Science. Denna forskning stöddes också av ministeriet för vetenskap och IKT (MSIT), Koreas nationella forskningsstiftelse (NRF-2019M3A9F3065868), ministeriet för hälsa och välfärd (MOHW), Korea Health Industry Development Institute (KHIDI, HI20C0558), Handels-, industri- och energiministeriet (MOTIE) och Korea Evaluation Institute of Industrial Technology (KEIT, 20009350). ORCID ID (Hee Min Yoo: 0000-0002-5951-2137; Dukjin Kang: 0000-0002-5924-9674; Seil Kim: 0000-0003-3465-7118; Joo-Eun Lee: 0000-0002-2495-1439; Jina Lee: 0000-0002-3661-3701). Vi tackar Chang Woo Park för hjälp med experiment.
Materials
10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 15-well, 15 µl |
Biorad | 4561036 | Pkg of 10 |
| Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | 100 covers |
| 10x transfer buffer | Intron | IBS-BT031A | 1 L |
| 10X Tris-Glycine (W/SDS) | Intron | IBS-BT014 | 1 L |
| Axygen 2.0 mL MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube, Polypropylene, Clear, Nonsterile, 500 Tubes/Pack, 10 Packs/Case | Corning | SCT-200-C | 500 Tubes/Pack, 10 Packs/Case |
| BD Difco Bacto Agar | BD | 214010 | 500 g |
| BD Difco Lactobacilli MRS Broth | BD | DF0881-17-5 | 500 g |
| CellTiter-Glo 3D Cell viability assay | Promega | G9681 | 100μl/assay in 96-well plates |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 11697498001 | vial of 20 tablets |
| Corning Phosphate-Buffered Saline, 1X without calcium and magnesium, PH 7.4 ± 0.1 | Corning | 21-040-CV | 500 mL |
| EMD Millipore Immobilon-P PVDF Transfer Membranes | fisher Scientific | IPVH00010 | 26.5cm x 3.75m roll; Pore Size: 0.45um |
| Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | 25/Pack, 500/Case |
| Fetal Bovine Serum, certified, US origin | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | 500 mL |
| iScript cDNA Synthesis Kit, 25 x 20 µl rxns #1708890 | Biorad | 1708890 | 25 x 20 µL rxns |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Biorad | 1725121 | 5 x 1 mL |
| Lactobacillus fermentum | Korean Collection for Type Cultures | KCTC 3112 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | C6852-25G | 25 g |
| Methyl Cellulose (3500-5600mPa·s, 2% in Water at 20°C) | TCI | M0185 | 500 g |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 mL | Applied Biosystems | 4346906 | 20 plates |
| Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 µm, mixed cellulose esters, 33 mm, ethylene oxide sterilized | Millipore | SLGS033SB | 250 |
| PE Annexin V Apoptosis Detection Kit with 7-AAD | Biolegend | 640934 | 100 tests |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 100 mL |
| Propidium Iodide | Introgen | P1304MP | 100 mg |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | Thermo Fisher Scientific | 89901 | 250 mL |
| RNeasy Mini Kit (250) | Qiagen | 74106 | 250 |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-119 | 500 mL |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | 100 mL |
| Name of Materials/Equipment/Software | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| anti – p-IκBα (B-9) | Santa cruze | sc-8404 | 200 µg/mL |
| anti-BclxL (H-5) | Santa cruze | sc-8392 | 200 µg/mL |
| anti-PARP 1 (C2-10) | Santa cruze | sc-53643 | 50 µl ascites |
| anti-β-actin (C4) | Santa cruze | sc-47778 | 200 µg/mL |
| BD FACSVerse | BD Biosciences | San Diego, CA, USA | |
| Synergy HTX Multi-Mode Microplate Reader | BioT | S1LFA | |
| CO2 incubator | Thermo fisher | HERAcell 150i | |
| Conical tube 15 ml | SPL | 50015 | |
| Conical tube 50 ml | SPL | 50050 | |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Sigma-Aldrich | CLS7007 | |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Sigma-Aldrich | CLS3471 | |
| Costar 50 mL Reagent Reservoirs, 5/Bag, Sterile | Costar | 4870 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermofisher | C10228 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | invitrogen | AMQAF1000 | |
| EnSpire Multimode Reader | Perkin Elmer | Enspire 2300 | |
| Eppendorf Research Plus Multi Channel Pipette, 8-channel | Eppendorf | 3122000051 | |
| FlowJo software | TreeStar | Ashland, OR, USA | |
| Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson immunoresearch | 115-035-062 | 1.5 mL |
| Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson immunoresearch | 111-035-144 | 2.0 mL |
| GraphPad Prism 5 | GraphPad Software | Inc., San Diego, CA, USA | |
| ImageJ | NIH | ||
| ImageQuant LAS 4000 mini | Fujifilm | Tokyo, Japan | |
| Incubated shaker | Lab companion | SIF-6000R | |
| Multi Gauge Ver. 3.0, | Fujifilm | Tokyo, Japan | |
| Optical density (OD)LAMBDA UV/Vis Spectrophotometers | Perkin Elmer | Waltham, MA, USA | |
| Phase-contrast microscope | Olympus | Tokyo, Japan | |
| SPL microcentrifuge tube 1.5mL | SPL | 60015 | |
| SPL Multi Channel Reservoirs, 12-Chs, PS, Sterile | SPL | 21012 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | Waltham, MA, USA | |
| Vibra-Cell Ultrasonic Liquid Processors | SONICS-vibra cell | VC 505 | 500 Watt ultrasonic processor |
| Vinyl Anaerobic Chamber | COY LAB PRODUCTS |
Referências
- Bron, P. A., Van Baarlen, P., Kleerebezem, M. Emerging molecular insights into the interaction between probiotics and the host intestinal mucosa. Nature Reviews Microbiology. 10 (1), 66-78 (2012).
- Ruiz, L., Delgado, S., Ruas-Madiedo, P., Sánchez, B., Margolles, A. Bifidobacteria and their molecular communication with the immune system. Frontiers in Microbiology. 8, 1-9 (2017).
- Sanders, M. E., Merenstein, D. J., Reid, G., Gibson, G. R., Rastall, R. A. Probiotics and prebiotics in intestinal health and disease: from biology to the clinic. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. 16 (10), 605-616 (2019).
- Pandey, K. R., Naik, S. R., Vakil, B. V. Probiotics, prebiotics and synbiotics- a review. Journal of Food Science and Technology. 52 (12), 7577-7587 (2015).
- Harish, K., Varghese, T. Probiotics in humans-evidence based review. Calicut Medical Journal. 4 (4), 3 (2006).
- Routy, B., et al. The gut microbiota influences anticancer immunosurveillance and general health. Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (6), 382-396 (2018).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. Most of the cell-based data-harvesting efforts that drive the integration of cell biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
- Jong, B. K. Three-dimensional tissue culture models in cancer biology. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 365-377 (2005).
- Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Scientific Reports. 6, 19103 (2016).
- Anton, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. Three-dimensional cell culture: A breakthrough in vivo. International Journal of Molecular Sciences. 16 (3), 5517-5527 (2015).
- Lee, J. E., et al. Characterization of the Anti-Cancer Activity of the Probiotic Bacterium Lactobacillus fermentum Using 2D vs. 3D Culture in Colorectal Cancer Cells. Biomolecules. 9 (10), 557 (2019).
- Koledova, Z. 3D cell culture: An introduction. Methods in Molecular Biology. 1612, (2017).
- Kapałczyńska, M., et al. 2D and 3D cell cultures – a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
- Langhans, S. A. Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning. Frontiers in Pharmacology. 9, 1-14 (2018).
- Breslin, S., O’Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: The missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
- Mazzocchi, A. R., Rajan, S. A. P., Votanopoulos, K. I., Hall, A. R., Skardal, A. In vitro patient-derived 3D mesothelioma tumor organoids facilitate patient-centric therapeutic screening. Scientific Reports. 8, 2886 (2018).
- Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery. Oncology Letters. 14 (6), 6999-7010 (2017).
- Thirumala, S., Gimble, J., Devireddy, R. Methylcellulose Based Thermally Reversible Hydrogel System for Tissue Engineering Applications. Cells. 2 (3), 460-475 (2013).
- Chandrashekran, A., et al. Methylcellulose as a scaffold in the culture of liver-organoids for the potential of treating acute liver failure. Cell and Gene Therapy Insights. 4 (11), 1087-1103 (2018).
- Lee, W., Park, J. 3D patterned stem cell differentiation using thermo-responsive methylcellulose hydrogel molds. Scientific Reports. 6, 1-11 (2016).
- Fan, H., Demirci, U., Chen, P. Emerging organoid models: Leaping forward in cancer research. Journal of Hematology and Oncology. 12 (1), 1-10 (2019).
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
- Liou, C. S., et al. A Metabolic Pathway for Activation of Dietary Glucosinolates by a Human Gut Symbiont. Cell. 180 (4), 717-728 (2020).
- Sherwin, E., Bordenstein, S. R., Quinn, J. L., Dinan, T. G., Cryan, J. F. Microbiota and the social brain. Science. 366 (6465), 2016 (2019).
- Honda, K., Littman, D. R. The microbiota in adaptive immune homeostasis and disease. Nature. 535 (7610), 75-84 (2016).
- Bárcena, C., et al. Healthspan and lifespan extension by fecal microbiota transplantation into progeroid mice. Nature Medicine. 25 (8), 1234-1242 (2019).
- Michalovich, D., et al. Obesity and disease severity magnify disturbed microbiome-immune interactions in asthma patients. Nature Communications. 10, 5711 (2019).
- Ansaldo, E., et al. Akkermansia muciniphila induces intestinal adaptive immune responses during homeostasis. Science. 364 (6446), 1179-1184 (2019).
