Valutazione della morte cellulare utilizzando un surnatante privo di cellule di probiotici in colture sferoidali tridimensionali di cellule tumorali del colon-retto
Summary
Qui vengono presentati i metodi per comprendere gli effetti anti-cancro del surnatante senza cellule di Lactobacillus (LCFS). Le linee cellulari del cancro del colon-retto mostrano decessi cellulari quando trattati con LCFS in colture 3D. Il processo di generazione degli sferoidi può essere ottimizzato a seconda dell’impalcatura e i metodi di analisi presentati sono utili per valutare le vie di segnalazione coinvolte.
Abstract
Questo manoscritto descrive un protocollo per valutare le morti delle cellule tumorali in sferoidi tridimensionali (3D) di tipi multicellulari di cellule tumorali utilizzando supernatanti da coltura cellulare di Lactobacillus fermentum , considerati come colture probiotiche. L’uso di colture 3D per testare il surnatante privo di cellule di Lactobacillus (LCFS) è un’opzione migliore rispetto al test in monostrati 2D, soprattutto perché L. fermentum può produrre effetti anti-cancro all’interno dell’intestino. L. fermentum supernatant è stato identificato per possedere un aumento degli effetti anti-proliferativi contro diverse cellule del cancro del colon-retto (CRC) in condizioni di coltura 3D. È interessante notare che questi effetti erano fortemente correlati al modello di coltura, dimostrando la notevole capacità di L. fermentum di indurre la morte delle cellule tumorali. Gli sferoidi stabili sono stati generati da diversi CRC (cellule tumorali del colon-retto) utilizzando il protocollo presentato di seguito. Questo protocollo di generazione di sferoidi 3D consente di risparmiare tempo ed è conveniente. Questo sistema è stato sviluppato per studiare facilmente gli effetti anti-cancro di LCFS in più tipi di sferoidi CRC. Come previsto, gli sferoidi CRC trattati con LCFS hanno fortemente indotto la morte cellulare durante l’esperimento ed espresso specifici marcatori molecolari di apoptosi analizzati mediante qRT-PCR, western blotting e analisi FACS. Pertanto, questo metodo è prezioso per esplorare la vitalità cellulare e valutare l’efficacia dei farmaci anti-cancro.
Introduction
I probiotici sono i microrganismi più vantaggiosi nell’intestino che migliorano l’omeostasi immunitaria e il metabolismo energetico dell’ospite1. I probiotici di Lactobacillus e Bifidobacterium sono i più avanzati del suo genere trovati nell’intestino2,3. Precedenti indagini hanno dimostrato che Lactobacillus ha effetti inibitori e antiproliferativi su diversi tumori, tra cui il cancro delcolon-retto 4. Inoltre, i probiotici prevengono le malattie infiammatorie intestinali, il morbo di Crohn e la colite ulcerosa5,6. Tuttavia, la maggior parte degli studi con probiotici sono stati eseguiti in monostrati bidimensionali (2D) che vengono coltivati su superfici solide.
I sistemi di coltura artificiale mancano di caratteristiche ambientali, il che non è naturale per le cellule tumorali. Per superare questa limitazione, sono stati sviluppati sistemi di coltura tridimensionali (3D)7,8. Le cellule tumorali in 3D mostrano miglioramenti in termini di meccanismi biologici di base, come la vitalità cellulare, la proliferazione, la morfologia, la comunicazione cellula-cellula, la sensibilità ai farmaci e la rilevanza in vivo9,10. Inoltre, gli sferoidi sono costituiti da tipi multicellulari di cancro del colon-retto e dipendono dalle interazioni cellula-cellula e dalla matrice extracellulare (ECM)11. Il nostro studio precedente ha riportato che il surnatante probiotico privo di cellule (CFS) prodotto utilizzando Lactobacillus fermentum ha mostrato effetti anti-cancro su colture 3D di cellule di cancro del colon-retto (CRC)12. Abbiamo proposto che la CFS sia una strategia alternativa adatta per testare gli effetti probiotici sugli sferoidi 3D12.
Qui, presentiamo un approccio che può ospitare tipi multicellulari di cancro del colon-retto 3D per l’analisi degli effetti terapeutici del surnatante probiotico senza cellule (CFS) su diversi sistemi di mimetismo del cancro del colon-retto 3D. Questo metodo fornisce un mezzo per l’analisi degli effetti probiotici e anti-cancro correlati in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il microambiente tissutale, comprese le cellule vicine e la matrice extracellulare (ECM), è fondamentale per la generazione dei tessuti e cruciale nel controllo della crescita cellulare e dello sviluppo dei tessuti13. Tuttavia, le colture 2D presentano diversi svantaggi, come l’interruzione delle interazioni cellulari, nonché alterazioni nella morfologia cellulare, ambienti extracellulari e l’approccio della divisione14. I sistemi di coltura cellulare 3D sono stati rigoro…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata supportata dalla “Istituzione di standard di misurazione per la chimica e le radiazioni”, numero di sovvenzione KRISS-2020-GP2020-0003, e “Sviluppo di standard di misurazione e tecnologia per biomateriali e convergenza medica”, numero di sovvenzione KRISS-2020-GP2020-0004 programmi, finanziati dal Korea Research Institute of Standards and Science. Questa ricerca è stata sostenuta anche dal Ministero della Scienza e delle TIC (MSIT), dalla National Research Foundation of Korea (NRF-2019M3A9F3065868), dal Ministero della Salute e del Welfare (MOHW), dal Korea Health Industry Development Institute (KHIDI, HI20C0558), dal Ministero del Commercio, dell’Industria e dell’Energia (MOTIE) e dal Korea Evaluation Institute of Industrial Technology (KEIT, 20009350). ID ORCID (Hee Min Yoo: 0000-0002-5951-2137; Dukjin Kang: 0000-0002-5924-9674; Seil Kim: 0000-0003-3465-7118; Joo-Eun Lee: 0000-0002-2495-1439; Jina Lee: 0000-0002-3661-3701). Ringraziamo Chang Woo Park per l’assistenza con gli esperimenti.
Materials
10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 15-well, 15 µl |
Biorad | 4561036 | Pkg of 10 |
| Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | 100 covers |
| 10x transfer buffer | Intron | IBS-BT031A | 1 L |
| 10X Tris-Glycine (W/SDS) | Intron | IBS-BT014 | 1 L |
| Axygen 2.0 mL MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube, Polypropylene, Clear, Nonsterile, 500 Tubes/Pack, 10 Packs/Case | Corning | SCT-200-C | 500 Tubes/Pack, 10 Packs/Case |
| BD Difco Bacto Agar | BD | 214010 | 500 g |
| BD Difco Lactobacilli MRS Broth | BD | DF0881-17-5 | 500 g |
| CellTiter-Glo 3D Cell viability assay | Promega | G9681 | 100μl/assay in 96-well plates |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 11697498001 | vial of 20 tablets |
| Corning Phosphate-Buffered Saline, 1X without calcium and magnesium, PH 7.4 ± 0.1 | Corning | 21-040-CV | 500 mL |
| EMD Millipore Immobilon-P PVDF Transfer Membranes | fisher Scientific | IPVH00010 | 26.5cm x 3.75m roll; Pore Size: 0.45um |
| Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | 25/Pack, 500/Case |
| Fetal Bovine Serum, certified, US origin | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | 500 mL |
| iScript cDNA Synthesis Kit, 25 x 20 µl rxns #1708890 | Biorad | 1708890 | 25 x 20 µL rxns |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Biorad | 1725121 | 5 x 1 mL |
| Lactobacillus fermentum | Korean Collection for Type Cultures | KCTC 3112 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | C6852-25G | 25 g |
| Methyl Cellulose (3500-5600mPa·s, 2% in Water at 20°C) | TCI | M0185 | 500 g |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 mL | Applied Biosystems | 4346906 | 20 plates |
| Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 µm, mixed cellulose esters, 33 mm, ethylene oxide sterilized | Millipore | SLGS033SB | 250 |
| PE Annexin V Apoptosis Detection Kit with 7-AAD | Biolegend | 640934 | 100 tests |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 100 mL |
| Propidium Iodide | Introgen | P1304MP | 100 mg |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | Thermo Fisher Scientific | 89901 | 250 mL |
| RNeasy Mini Kit (250) | Qiagen | 74106 | 250 |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-119 | 500 mL |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | 100 mL |
| Name of Materials/Equipment/Software | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| anti – p-IκBα (B-9) | Santa cruze | sc-8404 | 200 µg/mL |
| anti-BclxL (H-5) | Santa cruze | sc-8392 | 200 µg/mL |
| anti-PARP 1 (C2-10) | Santa cruze | sc-53643 | 50 µl ascites |
| anti-β-actin (C4) | Santa cruze | sc-47778 | 200 µg/mL |
| BD FACSVerse | BD Biosciences | San Diego, CA, USA | |
| Synergy HTX Multi-Mode Microplate Reader | BioT | S1LFA | |
| CO2 incubator | Thermo fisher | HERAcell 150i | |
| Conical tube 15 ml | SPL | 50015 | |
| Conical tube 50 ml | SPL | 50050 | |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Sigma-Aldrich | CLS7007 | |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Sigma-Aldrich | CLS3471 | |
| Costar 50 mL Reagent Reservoirs, 5/Bag, Sterile | Costar | 4870 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermofisher | C10228 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | invitrogen | AMQAF1000 | |
| EnSpire Multimode Reader | Perkin Elmer | Enspire 2300 | |
| Eppendorf Research Plus Multi Channel Pipette, 8-channel | Eppendorf | 3122000051 | |
| FlowJo software | TreeStar | Ashland, OR, USA | |
| Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson immunoresearch | 115-035-062 | 1.5 mL |
| Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson immunoresearch | 111-035-144 | 2.0 mL |
| GraphPad Prism 5 | GraphPad Software | Inc., San Diego, CA, USA | |
| ImageJ | NIH | ||
| ImageQuant LAS 4000 mini | Fujifilm | Tokyo, Japan | |
| Incubated shaker | Lab companion | SIF-6000R | |
| Multi Gauge Ver. 3.0, | Fujifilm | Tokyo, Japan | |
| Optical density (OD)LAMBDA UV/Vis Spectrophotometers | Perkin Elmer | Waltham, MA, USA | |
| Phase-contrast microscope | Olympus | Tokyo, Japan | |
| SPL microcentrifuge tube 1.5mL | SPL | 60015 | |
| SPL Multi Channel Reservoirs, 12-Chs, PS, Sterile | SPL | 21012 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | Waltham, MA, USA | |
| Vibra-Cell Ultrasonic Liquid Processors | SONICS-vibra cell | VC 505 | 500 Watt ultrasonic processor |
| Vinyl Anaerobic Chamber | COY LAB PRODUCTS |
Referências
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