Автоматизированное дифференциальное ядерное окрашивание анализ для точного определения цитотоксичности митокана
Summary
Протокол описывает быструю, высокую пропускную способность, надежную, недорогую и непредвзятую оценку для эффективного определения жизнеспособности клеток. Этот анализ особенно полезен, когда митохондрии клеток были повреждены, что мешает другим анализам. Анализ использует автоматизированный подсчет клеток, окрашенных двумя ядерными красителями – Hoechst 33342 и йодидом пропидия.
Abstract
Вклад митохондрий в онкогенную трансформацию является предметом широкого интереса и активного изучения. По мере того как поле метаболизма рака будет более сложным, цель пристрелить митохондрии используя различные соединения которые inflict митохондриальное повреждение (so-called митоканы) будет довольно популярным. К сожалению, многие существующие анализы цитотоксии, такие как тетразолиумные соли или резазурин, требуют функциональных митохондриальных ферментов для их работы. Ущерб, нанесенный соединениями, нацеленными на митохондрии, часто ставит под угрозу точность этих анализов. Здесь мы описываем измененный протокол, основанный на дифференциальном окрашивание двумя флуоресцентными красителями, один из которых является клеточным проницателем (Hoechst 33342), а другой не является (propidium iodide). Разница в окрашивание позволяет живых и мертвых клеток, которые будут дискриминированы. Анализ подменяется для автоматизированной микроскопии и анализа изображений, что увеличивает пропускную способность и уменьшает предвзятость. Это также позволяет использовать анализ в высокой пропускной способности моды с использованием 96-хорошо пластин, что делает его жизнеспособным вариантом для усилий по обнаружению наркотиков, особенно когда наркотики в вопросе имеют некоторый уровень митотоксичности. Важно отметить, что результаты, полученные Hoechst / PI окрашивания анализ показывают повышенную последовательность, как с trypan синий результаты исключения и между биологическими репликациями, когда анализ по сравнению с другими методами.
Introduction
Первым шагом к выявлению эффективных методов лечения рака является выбор надежного, беспристрастного анализа цитотоксичности, который может быть использован для изучения эффекта лечения. Распространенным выбором для экспериментов с низкой пропускной способностью является исключение трипанового синего красителя из живых клеток. Этот метод является благоприятствования, поскольку он позволяет относительно беспристрастный метод количественной оценки выживания клеток. trypan синий пассивно рассеивается в клетки, мембраны которых скомпрометированы, но это эффективно блокируется от входа здоровых клеток1. Коэффициент живых клеток и общей клетки представляет собой процент жизнеспособности, что указывает на эффективность лечения. Наиболее существенным недостатком trypan синий анализ является то, что он плохо подходит для высокой пропускной способности методологии. Он имеет относительно низкий коэффициент сигнала к шуму и длительное окрашивание может привести к артефактам из-за окрашивания жизнеспособных клеток. Следовательно, trypan синий исключение, как правило, но невсегда 2, низведена до ручного подсчета. Это делает его слишком медленным и вводит сильную возможность смещения из-за субъективного суждения исследователя (если не используются ослепляющие или независимые подсчеты, которые еще больше уменьшают пропускную способность лаборатории). В целом, пропускная способность этого анализа недостаточна для современных открытий наркотиков.
Анализ жизнеспособности, которые, как правило, имеют гораздо более высокую пропускную способность, позволяют исследователям обойти это ограничение, но приходят со значительными оговорками (см. таблицу 1). Эти методы обычно подпадают под две группы. Одна группа состоит из колоритных анализов, которые основаны на функции клеточных ферментов редокса. Бесцветные или нефлуоресцентные субстраты преобразуются в яркие продукты, которые можно количественно оценить с помощью спектрофотометра. Классическими примерами являются тетразолийные соли (МТТ, WST-1, XTT и т.д.) и резазурин. Эта категория также включает люминесцентные анализы, которые используют люциферин для оценки уровня АТФ. Анализы этого типа имеют основное ограничение, что они измеряют клеточный метаболизм, который не является клеточной жизнеспособности как таковой. Это довольно часто для клеток, чтобы стать тихие в неблагоприятных условиях, но все жесохранить способность разделить 3,4,5. Например, раковые стволовые клетки часто относительно метаболическитихие 6,7,8,9, и, вероятно, будет трудно продать с помощью этих методов. Эффективность лечения, которые повреждают митохондриальные функции, такие как большинство митоканов, также, вероятно, будет значительно завышена.
Альтернативная методология использует химические свойства различных веществ, которые позволяют им либо пересекать или не пересекать биологические мембраны. Одним из примеров являются ядерные пятна, такие как SYTOX или йодид пропидия (PI). Эта категория также включает в себя анализы, которые похожи по концепции, но отличаются по функциям, таким как лактат дегидрогеназа (LDH) анализ, который измеряет высвобождение LDH во внеклеточной среде в качестве индикатора клеточного некроза(рисунок 1, Таблица 1). Эти анализы более способны различать метаболически неактивные и мертвые клетки.
| Анализ/краситель | Тип (ы) обнаруженной клеточной смерти | Необходимое оборудование | Основные функции |
| МТТ, ККК-8, Аламар Блю (резазурин) | Апоптоз/Некроз | Спектрофотометр | Недорогой, быстрый; анализ конечных точек; зависит от активности ферментов (исключительно митохондриальных в случае МТТ) и не проводит различий между способамиклеточной смерти 1,10 |
| Выпуск LDH | Некроз | Спектрофотометр | Быстрая, независимая от активности митохондриальных ферментов; дорогие для высокой пропускной способности тестов; обнаруживает некротические клетки с компромиссной плазменноймембраной 11,12 |
| Трипан Блю (TB) | Апоптоз/Некроз | Микроскоп | Сотовый непроницаемый; не проводит различий между способами клеточной смерти; трудоемкий и не подходит для высокой пропускной способности скрининга; более трудно использовать с адептом клеток; склонны к субъективному суждению пользователя, но считается стандартным методом измерения жизнеспособностиклеток 13 |
| Акридин оранжевый (АО) | Апоптоз/Некроз/ | Флуоресцентный микроскоп | Нуклеиновой кислотный краситель с уникальными спектральными свойствами, может различать апоптоз и некроз/некроптоз14 |
| Некроптоз | |||
| Хохст 33342, DAPI | Апоптоза | Флуоресцентный микроскоп или цитометр потока | Сотовый проницаем; неподходящий сам по себе для мониторинга смерти клеток; полезно для совместного окрашивания; может быть использован для оценки конденсата хроматина и фрагментации ядер при раннем апоптозе; можно спарить с йодидом пропидия для того чтобы различить апоптоз отнекроза 15.16 |
| Пропидий йодид (PI) | Поздний апоптоз/некроз | Флуоресцентный микроскоп или цитометр потока | Сотовый империальный интеркалатор; обнаруживает как поздний апоптоз, так и режимы некроза клеточной смерти17. Токсичные и проницаемые после длительного инкубациираз 18 |
Таблица 1. Список анализов цитотоксичности. Анализы цитотоксичности, некоторые из которых были использованы в данном исследовании, перечислены вместе с кратким описанием их ключевых особенностей.
Недавние исследования показали, что митохондриальный метаболизм изменяется внекоторых видах рака 19,20,21, 22,23,24,25. Например, было показано, что острые миелоидные лейкозы (АМЛ) upregulate их митохондриальной массы, содержание мтДНК, и митохондриальногодыхания для удовлетворения своих потребностей в энергии 19,26,27. С другой стороны, некоторые твердые опухоли характеризуются митохондриальной дисфункцией, или, скорее, “метаболическим перепрограммированием”, такими как даунрегуляция митохондриальных белков, участвующих в OXPHOS или снижение содержания мтДНК, что было связано с инвазивностью опухоли, метастатическим потенциалом и устойчивостью к апоптоза вызывающихпрепараты 28,29. Кроме того, в последнее время возрос интерес к использованию механистически разнообразных соединений, влияющих на митохондриальную функцию (обычноназываемых митоканами 30),в качестве потенциальных методов лечения конкретных видов рака. Эти препараты нацелены на синтез АТФ, митохондриальной ДНК, OXPHOS и ROS производства, а также про-апоптотических и анти-апоптотических белков, связанных смитохондриями 30,31. Несколько исследований показали, что этот подход имеет значительныеперспективы 19,32,33,34. Тем не менее, эти метаболические отклонения в биологии раковых клеток или митохондрий ориентации лечения может значительно повлиять на обычные анализы жизнеспособности, которые основаны на митохондриальной функциональности.
Здесь описан оптимизированный протокол для дифференциального анализа ядерного окрашивания. Протокол позволяет быстро и точно определить цитотоксику митоканов или их комбинации с другими соединениями. Hoechst 33342 является клеточным ядерным красителем, который легко пересекает клеточные мембраны, чтобы окрашивать ДНК, что позволяет получить общее количество клеток. Путем совместного окрашивания с PI, который только входит в ядра мертвых клеток, доля живых (только Hoechst) и мертвых (окрашенных с обоими) клетки могут быть точно определены. Этот протокол уточняет опубликованный анализ35, добавляя шаг для оптимизации концентрации красителя (путем перекрестных ссылок результатов с ортогональным методом трипан синий) и центрифугации пластины до визуализации. Поскольку многие клеточные линии являются полуприемляемы или приостановлены, центрифуга увеличивает долю клеток, которые изображены и сильно повышает точность. Анализ имеет ряд преимуществ, в том числе, что окрашивание не требует удаления средств массовой информации или стирки. Смесь красителя также недорога, проста в подготовке и совместима с многоканальные/роботизированные трубоугляемые системы.
После того, как клетки были окрашены, они изображены с помощью автоматизированного микроскопа. Это имеет дополнительное преимущество создания постоянной записи изображений, которые могут быть повторно проанализированы позже и последствия конкретных соединений могут быть переоценены путем визуального осмотра захваченных изображений. После получения изображений ячейки могут быть подсчитаны вручную или с помощью любого из нескольких пакетов программного обеспечения, включая как бесплатные (например, ImageJ, CellProfiler и т.д.), так и коммерческое программное обеспечение (например, Metamorph, Gen5 и т.д.). Автоматизированный подсчет ячеев, как правило, предпочтительнее, так как правильно разработанные автоматизированные конвейеры подсчета ячеев являются более точными и менее предвзятыми, чем ручные подсчеты. Они также более эффективно игнорируют клеточный мусор или нерастворимые комплексы. Разработка этих трубопроводов, как правило, проста и упрощается эффективностью используемых пятен. Выход является количественным, так как фактическое количество мертвых ячеек автоматически рассчитывается в отношении общего числа клеток, и различные пороги могут быть применены для увеличения или уменьшения строки обнаружения35. Для удобства включены оптимизированные параметры для подсчета ячеек с использованием программного обеспечения Gen5 v. 3.00, совместимого с Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader.
Protocol
Representative Results
Discussion
Хотя протокол анализа цитотоксичности Hoechst/PI является надежным и требует сравнительно небольшого практического времени, существует несколько экспериментальных деталей, которые очень важны для обеспечения точных результатов. Во-первых, необходимо убедиться, что концентрация ДМСО ост…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NVK, CPRIT ученый в области исследований рака, благодаря профилактике рака и научно-исследовательский институт Техаса (CPRIT) за их щедрую поддержку, ГРАНТ CPRIT RR150044. Эта работа была также поддержана Уэлч Фонд исследований Грант C-1930, и Национальные институты здравоохранения R35 GM129294 присуждена NVK. Спонсоры не играли никакой роли в разработке, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.
Materials
| 2-Deoxy-D-glucose/2-DG | Chem-Impex | 50-519-067 | |
| 3-bromo-pyruvate | Alfa Aesar | 1113-59-3 | |
| 96-Well plates | Greiner Bio-One | 655090 | Black or clear flat-bottomed 96-well plates |
| Alamar blue HS cell viability reagent (100mL) | Thermo Fisher | A50101 | |
| Countess II automated cell counter | Thermo Fisher | ||
| Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader | BioTek | ||
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | 62249 | 20 mM solution; final concentration 1:1,000 |
| HyClone fetal bovine serum | GE Healthcare | #25-514 | |
| m-chlorophenylhydrazone/CCCP | Sigma Aldrich | C2759 | |
| PBS tablets | Thermo Fisher | BP2944100 | 1 tablet + 200 mL of sterile water = 1x PBS solution |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X) | Gibco | 10378016 | |
| Pierce LDH assay kit | Thermo Fisher | 50-103-5952 | |
| Propidium Iodide | Thermo Fisher | 50-596-072 | Dry powder; stock 1 mg/mL in PBS; final concentration 5 µg/mL (leukemia cells), 1 µg/mL (normal PBMCs) |
| Rotenone | Ark Pharm | AK115691 | |
| RPMI-1640 Medium With L-glutamine and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture |
Sigma Aldrich | R8758-500ML | |
| Thiazolyl blue tetrazolium bromide | ACROS Organics | AC158990010 | |
| Trypan blue stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Cell lines | |||
| K562 | ATCC | CCL-243 | CML cell line |
| MOLM-13 | ATCC | AML cell line |
|
| MOLT-4 | ATCC | CRL-1582 | ALL cell line |
| OCI-AML2 | ATCC | AML cell line |
|
Referências
- Ramirez, C. N., Antczak, C., Djaballah, H. Cell viability assessment: toward content-rich platforms. Expert Opinion on Drug Discovery. 5 (3), 223-233 (2010).
- Melzer, S., et al. Trypan blue as an affordable marker for automated live-dead cell analysis in image cytometry. Scanning. 38 (6), 857-863 (2016).
- Sikora, E., Mosieniak, G., Sliwinska, M. A. Morphological and Functional Characteristic of Senescent Cancer Cells. Current Cancer Drug Targets. 17 (4), 377-387 (2016).
- Coppé, J. P., Desprez, P. Y., Krtolica, A., Campisi, J. The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression. Annual Review of Pathology. 5, 99-118 (2010).
- Castro-Vega, L. J., et al. The senescent microenvironment promotes the emergence of heterogeneous cancer stem-like cells. Carcinogenesis. 36 (10), 1180-1192 (2015).
- Weihua, Z., Lin, Q., Ramoth, A. J., Fan, D., Fidler, I. J. Formation of solid tumors by a single multinucleated cancer cell. Cancer. 117 (17), 4092-4099 (2011).
- Osisami, M., Keller, E. T. Mechanisms of Metastatic Tumor Dormancy. Clinical Medicine. 2 (3), 136-150 (2013).
- Zhang, S., et al. Generation of cancer stem-like cells through the formation of polyploid giant cancer cells. Oncogene. 33 (1), 116-128 (2014).
- Mittal, K., et al. Multinucleated polyploidy drives resistance to Docetaxel chemotherapy in prostate cancer. British Journal of Cancer. 116 (9), 1186-1194 (2017).
- McKeague, A. L., Wilson, D. J., Nelson, J. Staurosporine-induced apoptosis and hydrogen peroxide-induced necrosis in two human breast cell lines. British Journal of Cancer. 88 (1), 125-131 (2003).
- Kaja, S., et al. An optimized lactate dehydrogenase release assay for screening of drug candidates in neuroscience. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 73, 1-6 (2015).
- Chan, F. K., Moriwaki, K., De Rosa, M. J. Detection of necrosis by release of lactate dehydrogenase activity. Methods in Molecular Biology. 979, 65-70 (2013).
- Piccinini, F., Tesei, A., Arienti, C., Bevilacqua, A. Cell Counting and Viability Assessment of 2D and 3D Cell Cultures: Expected Reliability of the Trypan Blue Assay. Biological Procedures Online. 19, 8 (2017).
- Plemel, J. R., et al. Unique spectral signatures of the nucleic acid dye acridine orange can distinguish cell death by apoptosis and necroptosis. Journal of Cell Biology. 216 (4), 1163-1181 (2017).
- Galluzzi, L., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death & Differentiation. 16 (8), 1093-1107 (2009).
- Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. Measurement of cell death in mammalian cells. Current Protocols in Pharmacology. , (2004).
- Brauchle, E., Thude, S., Brucker, S. Y., Schenke-Layland, K. Cell death stages in single apoptotic and necrotic cells monitored by Raman microspectroscopy. Scientific Reports. 4, 4698 (2014).
- Chiaraviglio, L., Kirby, J. E. Evaluation of impermeant, DNA-binding dye fluorescence as a real-time readout of eukaryotic cell toxicity in a high throughput screening format. Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 219-228 (2014).
- Panina, S. B., Baran, N., Brasil da Costa, F. H., Konopleva, M., Kirienko, N. V. A mechanism for increased sensitivity of acute myeloid leukemia to mitotoxic drugs. Cell Death & Disease. 10 (8), 617 (2019).
- Caro, P., et al. Metabolic signatures uncover distinct targets in molecular subsets of diffuse large B cell lymphoma. Cancer Cell. 22 (4), 547-560 (2012).
- Lagadinou, E. D., et al. BCL-2 inhibition targets oxidative phosphorylation and selectively eradicates quiescent human leukemia stem cells. Cell Stem Cell. 12 (3), 329-341 (2013).
- Senft, D., Ronai, Z. A. Regulators of mitochondrial dynamics in cancer. Current Opinion in Cell Biology. 39, 43-52 (2016).
- Vazquez, F., et al. PGC1α expression defines a subset of human melanoma tumors with increased mitochondrial capacity and resistance to oxidative stress. Cancer Cell. 23 (3), 287-301 (2013).
- Caino, M. C., Altieri, D. C. Cancer cells exploit adaptive mitochondrial dynamics to increase tumor cell invasion. Cell Cycle. 14 (20), 3242-3247 (2015).
- Ralph, S. J., Rodríguez-Enríquez, S., Neuzil, J., Saavedra, E., Moreno-Sánchez, R. The causes of cancer revisited: “mitochondrial malignancy” and ROS-induced oncogenic transformation – why mitochondria are targets for cancer therapy. Molecular Aspects of Medicine. 31 (2), 145-170 (2010).
- Kreitz, J., et al. Metabolic Plasticity of Acute Myeloid Leukemia. Cells. 8 (8), (2019).
- Sriskanthadevan, S., et al. AML cells have low spare reserve capacity in their respiratory chain that renders them susceptible to oxidative metabolic stress. Blood. 125 (13), 2120-2130 (2015).
- Guerra, F., et al. Mitochondrial Dysfunction: A Novel Potential Driver of Epithelial-to-Mesenchymal Transition in Cancer. Frontiers in Oncology. 7, 295 (2017).
- Guerra, F., Arbini, A. A., Moro, L. Mitochondria and cancer chemoresistance. Biochimica et Biophysica Acta. 1858 (8), 686-699 (2017).
- Neuzil, J., Dong, L. F., Rohlena, J., Truksa, J., Ralph, S. J. Classification of mitocans, anti-cancer drugs acting on mitochondria. Mitochondrion. 13 (3), 199-208 (2013).
- Ubah, O. C., Wallace, H. M. Cancer therapy: Targeting mitochondria and other sub-cellular organelles. Current Pharmaceutical Design. 20 (2), 201-222 (2014).
- Yamaguchi, R., et al. Efficient elimination of cancer cells by deoxyglucose-ABT-263/737 combination therapy. PLoS One. 6 (9), 24102 (2011).
- Hahn, T., et al. Use of anti-cancer drugs, mitocans, to enhance the immune responses against tumors. Current Pharmaceutical Biotechnology. 14 (3), 357-376 (2013).
- Panina, S. B., Pei, J., Baran, N., Konopleva, M., Kirienko, N. V. Utilizing Synergistic Potential of Mitochondria-Targeting Drugs for Leukemia Therapy. Frontiers in Oncology. 10, 435 (2020).
- Lema, C., Varela-Ramirez, A., Aguilera, R. J. Differential nuclear staining assay for high-throughput screening to identify cytotoxic compounds. Current Cellular Biochemistry. 1 (1), 1-14 (2011).
- Döhner, H., et al. Diagnosis and management of acute myeloid leukemia in adults: recommendations from an international expert panel, on behalf of the European LeukemiaNet. Blood. 115 (3), 453-474 (2010).
- Heinz, S., et al. Mechanistic Investigations of the Mitochondrial Complex I Inhibitor Rotenone in the Context of Pharmacological and Safety Evaluation. Scientific Reports. 7, 45465 (2017).
- Fan, T., et al. Tumor Energy Metabolism and Potential of 3-Bromopyruvate as an Inhibitor of Aerobic Glycolysis: Implications in Tumor Treatment. Cancers (Basel). 11 (3), (2019).
- Pal, R., Mamidi, M. K., Das, A. K., Bhonde, R. Diverse effects of dimethyl sulfoxide (DMSO) on the differentiation potential of human embryonic stem cells. Archives of Toxicology. 86 (4), 651-661 (2012).
- Tunçer, S., et al. Low dose dimethyl sulfoxide driven gross molecular changes have the potential to interfere with various cellular processes. Scientific Reports. 8 (1), 14828 (2018).
