マイトカン細胞毒性の正確な決定のための自動差動核染色アッセイ
Summary
このプロトコルは、細胞の生存率を効率的に決定するための、高速で高スループット、信頼性、安価、および公平なアッセイを記述します。このアッセイは、細胞のミトコンドリアが損傷し、他のアッセイに干渉する場合に特に有用である。このアッセイは、Hoechst 33342とヨウ化プロピジウムの2つの核染料で染色された細胞の自動カウントを使用します。
Abstract
発癌性転換へのミトコンドリアの寄与は、広い関心と活発な研究の対象である。がん代謝の分野が複雑化する中で、ミトコンドリアの損傷を与える様々な化合物(いわゆるミトカン)を用いてミトコンドリアを標的にするという目標が非常に人気を集めています。残念なことに、テトラゾリウム塩やレサズリンに基づくものなど、多くの既存の細胞傷害性アッセイは、その性能のために機能的なミトコンドリア酵素を必要とします。ミトコンドリアを標的とする化合物によって与える損傷は、しばしばこれらのアッセイの正確さを損なう。ここでは、2つの蛍光色素による微分染色に基づく改変プロトコルについて説明するが、そのうちの1つは細胞透過性(Hoechst 33342)であり、他方は(ヨウ化プロピジウム)ではない。染色の違いにより、生きている細胞と死んだ細胞を区別することができます。このアッセイは、自動顕微鏡検査と画像解析に適しており、スループットを向上させ、バイアスを低減します。これにより、アッセイは96ウェルプレートを使用してハイスループットの方法で使用することができ、特に問題の薬物がある程度の有糸分裂性がある場合には、創薬の取り組みに実行可能な選択肢となる。重要なことに、Hoechst/PI染色アッセイによって得られた結果は、トリパンブルー排除結果と、アッセイが他の方法と比較されたときに生物学的複製の間の両方で、一貫性の増加を示す。
Introduction
効果的ながん治療を特定するための最初のステップは、治療の効果を調べるために使用できる堅牢で公平な細胞傷害性アッセイの選択です。低スループット実験の一般的な選択肢は、生細胞からのトリパンブルー染料の除外です。この方法は、細胞生存を定量化するための比較的公平な方法を可能にするので好ましい。trypanブルーは、膜が損なわれている細胞に受動的に拡散するが、健康な細胞1に入るのを効果的に遮断される。生きている細胞と全細胞の商は、治療の有効性を示す生存率の割合を表す。trypan blue アッセイの最も大きな欠点は、高スループットの方法論に適していることです。それは比較的低い信号対雑音比を有し、長期染色は、生存細胞の染色のために人工物をもたらす可能性がある。したがって、trypan blue の除外は通常、必ずしも2ではなく、手動カウントに降格されます。これはあまりにも遅くなり、研究者の主観的判断によるバイアスの可能性が強くなります(ブラインドまたは独立したカウントを使用しない限り、実験室のスループットをさらに低下させます)。一般に、このアッセイのスループットは、現代の創薬には不十分です。
一般的にスループットがはるかに高い生存アッセイは、研究者がこの制限を回避することを可能にしますが、重大な注意点が付属しています(表1を参照)。これらの方法は、一般的に2つのグループに分類されます。1つのグループは、細胞レドックス酵素の機能に基づく比色アッセイで構成されています。無色または非蛍光基質は、分光光度計を使用して定量することができる活気に満ちた製品に変換されます。古典的な例としては、テトラゾリウム塩(MTT、WST-1、XTTなど)およびレサズリンが挙げられる。このカテゴリには、ATP レベルを評価するためにルシフェリンを利用する発光アッセイも含まれています。このタイプのアッセイは、細胞代謝を測定しているという根本的な制限を有するが、これは細胞の生存率それ過ではない。細胞が不利な条件下で静止することは非常に一般的ですが、それでも3、4、5を分割する能力を保持しています。例えば、癌幹細胞は、比較的代謝的に6、7、8、9であることが多く、これらの技術を用いてアッセイが困難である可能性が高い。ミトコンドリア機能を損なう治療の有効性も、ほとんどのミトカンなど、著しく過大評価される可能性が高い。
代替方法論は、生物学的膜を交差するか、または交差しないのいずれかを可能にする様々な物質の化学的性質を活用する。その一例が、SYTOXやヨウ化プロピジウム(PI)などの核染色である。このカテゴリには、細胞壊死の指標として細胞外ミリューへのLDHの放出を測定する乳酸脱水素酵素(LDH)アッセイのような概念は類似しているが機能が異なるアッセイも含まれる(図1、表1)。これらのアッセイは、代謝不活性細胞と死細胞を区別することがより可能である。
| アッセイ/染料 | 細胞死の種類が検出されました | 必要な機器 | 主な機能 |
| MTT, CKK-8, アラマーブルー (レザズリン) | アポトーシス/壊死 | 分光 光度 計 | 安価で、迅速。エンドポイントアッセイ;酵素の活性(MTTの場合はミトコンドリアのみ)に依存し、細胞死のモードを区別しない1,10 |
| LDH リリース | 壊死 | 分光 光度 計 | ミトコンドリア酵素の活性とは無関係の迅速な;高スループットテストの場合は高価です。コンプロマ化された形質膜11,12で壊死細胞を検出する |
| トリパンブルー(TB) | アポトーシス/壊死 | 顕微鏡 | 細胞非透過性;細胞死のモードを区別しません。働きがく、ハイスループットスクリーニングには適していません。接着細胞での使用がより困難。ユーザーの主観的判断を受けやすいが、標準的な細胞生存率測定方法13と考えられている |
| アクリジンオレンジ(AO) | アポトーシス/壊死/ | 蛍光顕微鏡 | 独特なスペクトル特性を有する核酸色素は、アポトーシスと壊死/ネクロトーシス14を区別できる |
| ネクロトーシス | |||
| ホークスト 33342, DAPI | アポトーシス | 蛍光顕微鏡またはフローサイトメーター | 細胞透過性;細胞死を監視するために単独で不適切。共同染色に有用である。初期アポトーシスにおけるクロマチン縮合と核断片化を評価するために使用することができます。ヨウ化プロピジウムと組み合わせることで、アポトーシスと壊死を区別することができます15,16 |
| ヨウ化プロピジウム(PI) | 後期アポトーシス/壊死 | 蛍光顕微鏡またはフローサイトメーター | 細胞非透過インターカレーター;細胞死17の後期アポトーシスおよび壊死モードの両方を検出する。長いインキュベーションの後の有毒で透過性18 |
表 1.細胞毒性アッセイのリスト細胞毒性アッセイは、その一部がこの研究で使用され、その主要な特徴の簡単な説明と共にリストされた。
最近の研究では、ミトコンドリア代謝が一部の癌で変化することが実証されています19,20,21,22,23,24,25.例えば、急性骨髄性白血病(AML)は、彼らのエネルギー需要19、26、27を満たすためにミトコンドリア質量、mtDNA含有量、およびミトコンドリア呼吸をアップレレートすることが示されている。一方、いくつかの固形腫瘍は、ミトコンドリア機能障害、またはむしろ「代謝リプログラミング」、OXPHOSに関与するミトコンドリアタンパク質のダウンレギュレーションやmtDNA含有量の低下など、腫瘍浸潤性、転移電位およびアポトーシス誘発薬28、29に対する耐性に関連している。さらに最近では、ミトコンドリア機能に影響を与える機械学的に多様な化合物(一般にミトカン30と呼ばれる)を特定の癌の潜在的な治療法として使用することに対する関心が高まっています。これらの薬物は、ATP合成、ミトコンドリアDNA、OXPHOS、およびROS産生、ならびにミトコンドリア30、31に関連するプロアポトーシスおよび抗アポトーシスタンパク質を標的とする。いくつかの研究は、このアプローチが重要な約束を持っていることを示しています19,32,33,34.しかし、がん細胞生物学やミトコンドリア標的治療におけるこれらの代謝偏差は、ミトコンドリア機能に基づく従来の生存アッセイに大きな影響を与える可能性があります。
ここでは、微分核染色アッセイ用の最適化されたプロトコルについて説明する。このプロトコルは、ミトカンの細胞毒性や他の化合物との組み合わせの迅速かつ正確な決定を可能にします。Hoechst 33342は細胞膜を容易に横切ってDNAを染色する細胞透過核色素であり、全細胞数が得られるようになる。死細胞の核にしか入るPIとの共染色により、生きている細胞(Hoechstのみ)と死んだ(両方で染色)細胞の割合を正確に決定することができる。このプロトコルは、(直交トリパンブルー法との交差参照結果による)およびイメージング前のプレートの遠心分離による色素濃度の最適化のためのステップを加えることによって、公表アッセイ35 を改良する。多くの細胞株は半接着または懸濁されているため、遠心分離は、画像化される細胞の割合を増加させ、精度を大幅に向上させます。アッセイには、染色が媒体の除去または洗浄を必要としないことを含むいくつかの利点がある。染料混合物はまた安価で、準備が容易で、多チャンネル/ロボティックピペットシステムと互換性がある。
細胞が染色された後、それらは自動化された顕微鏡でイメージされる。これは、後で再分析することができる画像の永久的な記録を作成し、特定の化合物の効果をキャプチャされた画像の目視検査によって再評価することができるという付加的な利点を有する。画像が取得されると、セルは手動で、または無料(ImageJ、CellProfilerなど)と商用ソフトウェア(例えば、変身、Gen5など)の両方を含むいくつかのソフトウェアパッケージのいずれかを使用してカウントすることができます。自動セルカウントは、一般に、自動セルカウントパイプラインが手動カウントよりも正確でバイアスが低いため、一般的に好ましいです。また、細胞の破片や不溶性複合体をより効果的に無視します。これらのパイプラインの開発は一般的に簡単であり、使用される汚れの効率によって簡素化されます。出力は、死細胞の実際の数が総細胞数に対して自動的に計算されるため定量的であり、異なる閾値を適用して検出35のストリンジェンシーを増減することができる。利便性のために、Gen5 v. 3.00ソフトウェア互換Cytation 5セルイメージングマルチモードリーダーを使用してセルをカウントするための最適化されたパラメータが含まれています。
Protocol
Representative Results
Discussion
Hoechst/PI細胞毒性アッセイのプロトコルは堅牢で、比較的実践的な時間を必要としますが、正確な結果を確実にするために非常に重要な実験的な詳細がいくつかあります。まず、DMSOの濃度が0.5%(v/v)未満であることを確認することが不可欠です。DMSOの低用量への暴露は、細胞の形態および付着を実質的に変化させ、細胞周期進行を39,40に著しく遅らせることができるというこ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
がん研究のCPRIT学者であるNVKは、テキサス州がん予防研究所(CPRIT)の寛大な支援、CPRIT助成金RR150044に感謝します。この研究は、ウェルチ財団研究助成金C-1930、およびNVKに授与された国立衛生研究所R35 GM129294によっても支援されました。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、出版の決定、原稿の作成に何の役割も持っていませんでした。
Materials
| 2-Deoxy-D-glucose/2-DG | Chem-Impex | 50-519-067 | |
| 3-bromo-pyruvate | Alfa Aesar | 1113-59-3 | |
| 96-Well plates | Greiner Bio-One | 655090 | Black or clear flat-bottomed 96-well plates |
| Alamar blue HS cell viability reagent (100mL) | Thermo Fisher | A50101 | |
| Countess II automated cell counter | Thermo Fisher | ||
| Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader | BioTek | ||
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | 62249 | 20 mM solution; final concentration 1:1,000 |
| HyClone fetal bovine serum | GE Healthcare | #25-514 | |
| m-chlorophenylhydrazone/CCCP | Sigma Aldrich | C2759 | |
| PBS tablets | Thermo Fisher | BP2944100 | 1 tablet + 200 mL of sterile water = 1x PBS solution |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X) | Gibco | 10378016 | |
| Pierce LDH assay kit | Thermo Fisher | 50-103-5952 | |
| Propidium Iodide | Thermo Fisher | 50-596-072 | Dry powder; stock 1 mg/mL in PBS; final concentration 5 µg/mL (leukemia cells), 1 µg/mL (normal PBMCs) |
| Rotenone | Ark Pharm | AK115691 | |
| RPMI-1640 Medium With L-glutamine and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture |
Sigma Aldrich | R8758-500ML | |
| Thiazolyl blue tetrazolium bromide | ACROS Organics | AC158990010 | |
| Trypan blue stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Cell lines | |||
| K562 | ATCC | CCL-243 | CML cell line |
| MOLM-13 | ATCC | AML cell line |
|
| MOLT-4 | ATCC | CRL-1582 | ALL cell line |
| OCI-AML2 | ATCC | AML cell line |
|
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