En automatisert differensial kjernefysisk farging analyse for nøyaktig bestemmelse av mititokancytoktoksisitet

Summary

Protokollen beskriver en rask, høy gjennomstrømning, pålitelig, billig og objektiv analyse for effektivt å bestemme cellulær levedyktighet. Denne analysen er spesielt nyttig når cellenes mitokondrier har blitt skadet, noe som forstyrrer andre analyser. Analysen bruker automatisert telling av celler farget med to kjernefysiske fargestoffer – Hoechst 33342 og propidiumjodid.

Abstract

Bidraget fra mitokondrier til onkogen transformasjon er gjenstand for bred interesse og aktiv studie. Etter hvert som feltet av kreftmetabolismen blir mer kompleks, blir målet om å målrette mitokondrier ved hjelp av ulike forbindelser som forårsaker mitokondrieskade (såkalte mitokaner) ganske populært. Dessverre krever mange eksisterende cytotoksisitetsanalyser, som de som er basert på tetrazoliumsalter eller resazurin funksjonelle mitokondrieenzymer for ytelsen. Skaden påført av forbindelser som retter seg mot mitokondrier, kompromitterer ofte nøyaktigheten av disse analysene. Her beskriver vi en modifisert protokoll basert på differensialfarging med to fluorescerende fargestoffer, hvorav den ene er cellepermeant (Hoechst 33342) og den andre som ikke er (propidiumjodid). Forskjellen i farging gjør at levende og døde celler kan diskrimineres. Analysen er mottagelig for automatisert mikroskopi og bildeanalyse, noe som øker gjennomstrømningen og reduserer skjevhet. Dette gjør det også mulig for analysen å bli brukt i høy gjennomstrømning mote ved hjelp av 96-brønnplater, noe som gjør det til et levedyktig alternativ for narkotika oppdagelse innsats, spesielt når de aktuelle stoffene har noen grad av mitotoxicity. Viktigere, resultatene oppnådd av Hoechst / PI farging analyse viser økt konsistens, både med trypan blå utelukkelse resultater og mellom biologiske replikere når analysen sammenlignes med andre metoder.

Introduction

Det første trinnet for å identifisere effektive kreftbehandlinger er valg av en robust, objektiv cytotoksisitetsanalyse som kan brukes til å undersøke effekten av behandlingen. Et vanlig valg for eksperimenter med lav gjennomstrømning er utelukkelse av trypan blå fargestoff fra levende celler. Denne metoden favoriseres fordi den tillater en relativt objektiv metode for å kvantifisere celleoverlevelse. trypan blå passivt sprer seg i celler hvis membraner er kompromittert, men det er effektivt blokkert fra å komme inn i friske celler¹. Kvotienten til de levende cellene og de totale cellene representerer prosentleveligheten, noe som indikerer effekten av behandlingen. Den viktigste ulempen med trypan blå analyse er at den er dårlig egnet for høy gjennomstrømningsmetoder. Den har et relativt lavt signal-til-støy-forhold, og langvarig farging kan resultere i artefakter på grunn av farging av levedyktige celler. Følgelig er trypan blå ekskludering vanligvis, men ikke^{alltid 2}, henvist til manuell telling. Dette gjør det for sakte og introduserer den sterke muligheten for skjevhet på grunn av subjektiv dom fra forskeren (med mindre blending eller uavhengige tellinger brukes, noe som ytterligere reduserer laboratoriegjennomstrømningen). Generelt er gjennomstrømningen av denne analysen utilstrekkelig for moderne narkotikaoppdagelse.

Levedyktighetsanalyser, som vanligvis har en mye høyere gjennomstrømning, tillater forskere å omgå denne begrensningen, men kommer med betydelige advarsler (se tabell 1). Disse metodene faller vanligvis inn i to grupper. En gruppe består av kolorimetriske analyser som er basert på funksjonen til cellulære redoksenzymer. Fargeløse eller ikke-fluorescerende substrater omdannes til levende produkter som kan kvantifiseres ved hjelp av et spektrofotometer. Klassiske eksempler inkluderer tetrazoliumsalter (MTT, WST-1, XTT osv.) og resazurin. Denne kategorien inkluderer også selvlysende analyser som bruker luciferin for å evaluere ATP-nivå. Analyser av denne typen har den underliggende begrensningen at de måler cellulær metabolisme, som ikke er cellulær levedyktighet per se. Det er ganske vanlig for celler å bli quiescent under ugunstige forhold, men fortsatt beholde evnen til å^{dele 3,4,5}. For eksempel er kreft stamceller ofte relativt metabolsk quiescent^6,7,8,9, og er sannsynlig å være vanskelig å analysere ved hjelp av disse teknikkene. Effektiviteten av behandlinger som skader mitokondriefunksjonen, som de fleste mitokaner, er også sannsynlig å bli betydelig overvurdert.

En alternativ metodikk utnytter de kjemiske egenskapene til ulike stoffer som tillater dem å enten krysse eller ikke krysse biologiske membraner. Et eksempel er kjernefysiske flekker som SYTOX eller propidiumjodid (PI). Denne kategorien inkluderer også analyser som er like i konseptet, men forskjellige i funksjon, for eksempel laktatdehydrogenase (LDH) analyse, som måler utgivelsen av LDH i det ekstracellulære miljøet som en indikator på cellulær nekrose (figur 1, tabell 1). Disse analysene er mer i stand til å skille mellom metabolsk inaktive og døde celler.

Analyse/fargestoff	Type(er) av celledød oppdaget	Nødvendig utstyr	Viktige funksjoner
MTT, CKK-8, Alamar Blå (resazurin)	Apoptose/nekrose	Spektrofotometer	Billig, rask; endepunktanalyse; avhengig av enzymers aktivitet (utelukkende mitokondrie i tilfelle MTT) og diskriminerer ikke mellom moduser forcelledød 1,10
LDH-utgivelse	Nekrose	Spektrofotometer	Rask, uavhengig av mitokondrieenzymers aktivitet; dyrt for høy gjennomstrømningstester; nekrotiske celler med kompromisert plasmamembran11,12
Trypan Blå (TB)	Apoptose/nekrose	Mikroskop	Celle-impermeant; diskriminerer ikke mellom moduser for celledød; arbeidskrevende og ikke egnet for screening med høy gjennomstrømming; vanskeligere å bruke med tiltalende celler; utsatt for subjektiv vurdering av brukeren, men regnes som standard celle levedyktighetsmålingsmetode13
Acridine oransje (AO)	Apoptose/nekrose/	Fluorescensmikroskop	En nukleinsyre fargestoff med unike spektrale egenskaper, kan skille mellom apoptose og nekrose / necroptosis14
	Nekroptose
Hoechst 33342, DAPI	Apoptose	Fluorescensmikroskop eller strømningscytometer	Cellegjennomtrengelig; upassende alene for å overvåke celledød; nyttig for co-farging; kan brukes til å vurdere kromatinkondensasjon og kjernefragmentering tidlig apoptose; kan pares med propidiumjodid for å skille apoptose fra nekrose15,16
Propidiumjodid (PI)	Sen apoptose/nekrose	Fluorescensmikroskop eller strømningscytometer	Celleimpermeant intercalator; oppdager både sen apoptose og nekrose moduser av celledød17. Giftig og gjennomtrengelig etter lange inkubasjonstider18

Tabell 1. Liste over cytotoksisitetsanalyser. Cytotoksisitetsanalyser, hvorav noen ble brukt i denne studien, oppført sammen med den korte beskrivelsen av deres viktigste funksjoner.

Nyere studier har vist at mitokondriemetabolismen er endret hos noen^{kreftformer 19,20,21,22,23,24,25}. For eksempel har akutt myelogen leukemi (AML) vist seg å oppregulere deres mitokondriemasse, mtDNA-innhold og mitokondrierespirasjon for å møte deres energibehov^19,26,27. På den annen side er noen faste svulster preget av mitokondriedysfunksjon, eller rettere sagt “metabolsk omprogrammering”, for eksempel nedregulering av mitokondrieproteiner involvert i OXPHOS eller redusert mtDNA-innhold, som har vært forbundet med tumorinvasivitet, metastatisk potensial og motstand mot apoptosefremkallende^{legemidler 28,29}. Videre har det nylig vært en økt interesse for å bruke mekanistisk forskjellige forbindelser som påvirker mitokondriefunksjonen (vanligvis kalt mitokaner^30),som potensielle behandlinger for bestemte kreftformer. Disse stoffene retter seg mot ATP-syntese, mitokondrie-DNA, OXPHOS og ROS-produksjon, samt pro-apoptotiske og antipoptotiske proteiner forbundet med mitokondrier^30,31. Flere studier har vist at denne tilnærmingen har betydelig løfte^19,32,33,34. Imidlertid kan disse metabolske avvikene i kreftcellebiologi eller mitokondrier-målretting behandlinger betydelig påvirke konvensjonelle levedyktighetsanalyser som er basert på mitokondriefunksjonalitet.

Her er en optimalisert protokoll for en differensial kjernefysisk farging analyse beskrevet. Protokollen tillater rask og nøyaktig bestemmelse av cytotoksisitet av mitokaner eller deres kombinasjoner med andre forbindelser. Hoechst 33342 er en celle-permeant kjernefysisk fargestoff som lett krysser cellemembraner å flekke DNA, slik at den totale celleantallet kan oppnås. Ved å sameksiere med PI, som bare kommer inn i kjernene av døde celler, kan andelen levende (kun Hoechst) og døde (farget med begge) celler bestemmes nøyaktig. Denne protokollen foredler den publiserte analysen³⁵ ved å legge til et trinn for optimalisering av fargekonsentrasjonen (ved å kryssreferere resultater med ortogonal trypan blå metode) og sentrifugering av platen før avbildning. Siden mange cellelinjer er semi-tilhenger eller suspendert, øker sentrifugering andelen celler som er avbildet og forbedrer nøyaktigheten sterkt. Analysen har flere fordeler, inkludert at farging ikke krever fjerning av media eller vasking. Fargestoffblandingen er også billig, enkel å tilberede og kompatibel med flerkanals /robotpipetteringssystemer.

Etter at cellene er farget, blir de avbildet med et automatisert mikroskop. Dette har den ekstra fordelen av å opprette en permanent oversikt over bildene som kan analyseres på nytt senere, og effekten av bestemte forbindelser kan evalueres på nytt ved visuell inspeksjon av tatt bilder. Når bilder er innhentet, kan celler telles enten manuelt eller ved å bruke noen av flere programvarepakker, inkludert både gratis (f.eks. ImageJ, CellProfiler, etc) og kommersiell programvare (f.eks. Metamorph, Gen5, etc). Automatisert celletelling er generelt å foretrekke siden riktig utviklede automatiserte celletellingsrørledninger er mer nøyaktige og mindre partisk enn manuelle tellinger. De ser også mer effektivt bort fra celleavfall eller uoppløselige komplekser. Utviklingen av disse rørledningene er generelt enkel og forenkles av effektiviteten av flekkene som brukes. Utdataene er kvantitative siden det faktiske antallet døde celler beregnes automatisk med hensyn til totalt cellenummer, og ulike terskler kan brukes til å øke eller redusere strengen av^{deteksjon 35}. For enkelhets skyld er optimaliserte parametere for å telle celler ved hjelp av Gen5 v. 3.00 programvarekompatibel Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader inkludert.

Protocol

1. Cytotoksisitet Analyse: Oppsett Forbered løsninger av interesseforbindelser ved ønskede konsentrasjoner i riktig medium (serumfri eller 1, 2,5 eller 5% FBS RPMI-1640). For å måle cytotoksisitet av en enkelt forbindelse (f.eks. for å bestemme effektive doser), forberede forbindelser ved 2x endelig konsentrasjon. For å måle cytotoksisitet av sammensatte kombinasjoner, forberede forbindelser ved 4x endelig konsentrasjon. Forbered løsemiddelkontroller ved å blande samme men…

Representative Results

Den nevnte protokollen er utviklet ved hjelp av OCI-AML2 celler, som ble tatt som en representativ akutt myelogen leukemi cellelinje. AML er preget av unormal spredning av udifferensierte og ikke-funksjonelle hematopoetiske celler i benmargen26. Til tross for den siste utviklingen i AML målrettet terapi, standarden på omsorg har vært uendret i flere tiår, og består av induksjonsbehandling (vanligvis består av tre dager med antracyklin, f.eks daunorubicin, idarubicin eller anthracenedione mit…

Discussion

Selv om protokollen for Hoechst/PI cytotoksisitetsanalyse er robust og krever relativt lite praktisk tid, er det flere eksperimentelle detaljer som er svært viktige for å sikre nøyaktige resultater. For det første er det viktig å sørge for at konsentrasjonen av DMSO forblir under 0,5% (v / v). Det er generelt avtalt at eksponering for selv lave doser av DMSO kan vesentlig endre morfologi og vedlegg av celler og betydelig forsinke celle syklus^{progresjon 39,40</sup…}

Materials

2-Deoxy-D-glucose/2-DG	Chem-Impex	50-519-067
3-bromo-pyruvate	Alfa Aesar	1113-59-3
96-Well plates	Greiner Bio-One	655090	Black or clear flat-bottomed 96-well plates
Alamar blue HS cell viability reagent (100mL)	Thermo Fisher	A50101
Countess II automated cell counter	Thermo Fisher
Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader	BioTek
Hoechst 33342	Thermo Fisher	62249	20 mM solution; final concentration 1:1,000
HyClone fetal bovine serum	GE Healthcare	#25-514
m-chlorophenylhydrazone/CCCP	Sigma Aldrich	C2759
PBS tablets	Thermo Fisher	BP2944100	1 tablet + 200 mL of sterile water = 1x PBS solution
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X)	Gibco	10378016
Pierce LDH assay kit	Thermo Fisher	50-103-5952
Propidium Iodide	Thermo Fisher	50-596-072	Dry powder; stock 1 mg/mL in PBS; final concentration 5 µg/mL (leukemia cells), 1 µg/mL (normal PBMCs)
Rotenone	Ark Pharm	AK115691
RPMI-1640 Medium With L-glutamine and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture	Sigma Aldrich	R8758-500ML
Thiazolyl blue tetrazolium bromide	ACROS Organics	AC158990010
Trypan blue stain (0.4%)	Gibco	15250-061
Cell lines
K562	ATCC	CCL-243	CML cell line
MOLM-13	ATCC		AML cell line
MOLT-4	ATCC	CRL-1582	ALL cell line
OCI-AML2	ATCC		AML cell line