Un saggio di colorazione nucleare differenziale automatizzato per una determinazione accurata della citotossicità mitocana
Summary
Il protocollo descrive un saggio rapido, ad alta produttività, affidabile, economico e imparziale per determinare in modo efficiente la vitalità cellulare. Questo saggio è particolarmente utile quando i mitocondri delle cellule sono stati danneggiati, il che interferisce con altri saggi. Il saggio utilizza il conteggio automatizzato delle celle macchiate con due coloranti nucleari: Hoechst 33342 e propidium ioduro.
Abstract
Il contributo dei mitocondri alla trasformazione oncogenica è oggetto di ampio interesse e studio attivo. Man mano che il campo del metabolismo del cancro diventa più complesso, l’obiettivo di colpire i mitocondri usando vari composti che infliggono danni mitocondriali (i cosiddetti mitocani) sta diventando abbastanza popolare. Sfortunatamente, molti saggi di citotossicità esistenti, come quelli a base di sali di tetrazolio o resazurina richiedono enzimi mitocondriali funzionali per le loro prestazioni. Il danno inflitto dai composti che prendono di mira i mitocondri spesso compromette l’accuratezza di questi saggi. Qui descriviamo un protocollo modificato basato sulla colorazione differenziale con due coloranti fluorescenti, uno dei quali è permeante alle cellule (Hoechst 33342) e l’altro non lo è (ioduro di propidio). La differenza di colorazione consente di discriminare le cellule vive e morte. Il saggio è suscettibile alla microscopia automatizzata e all’analisi delle immagini, che aumenta la produttività e riduce la distorsione. Ciò consente anche di utilizzare il saggio in modo ad alta produttività utilizzando piastre a 96 pozzi, rendendolo un’opzione praticabile per gli sforzi di scoperta di farmaci, in particolare quando i farmaci in questione hanno un certo livello di mitotossicità. È importante sottolineare che i risultati ottenuti dal saggio di colorazione Hoechst/PI mostrano una maggiore consistenza, sia con i risultati dell’esclusione blu del tripano che tra le repliche biologiche quando il saggio viene confrontato con altri metodi.
Introduction
Il primo passo per identificare trattamenti efficaci contro il cancro è la selezione di un test di citotossicità robusto e imparziale che può essere utilizzato per esaminare l’effetto del trattamento. Una scelta comune per esperimenti a bassa produttività è l’esclusione del colorante blu tripano dalle cellule viventi. Questo metodo è favorito perché consente un metodo relativamente imparziale per quantificare la sopravvivenza cellulare. trypan blue si diffonde passivamente in cellule le cui membrane sono compromesse, ma è effettivamente impedito di entrare nelle cellule sane1. Il quoziente delle cellule viventi e delle cellule totali rappresenta la vitalità percentuale, che indica l’efficacia del trattamento. Lo svantaggio più significativo del test blu del trypan è che è poco adatto per metodologie ad alta produttività. Ha un rapporto segnale-rumore relativamente basso e la colorazione prolungata può causare artefatti a causa della colorazione di cellule vitali. Di conseguenza, l’esclusione blu trypan è in genere, ma nonsempre 2, relegata al conteggio manuale. Questo lo rende troppo lento e introduce la forte possibilità di parzialità a causa del giudizio soggettivo del ricercatore (a meno che non vengano utilizzati conteggi accecante o indipendenti, che riducono ulteriormente la produttività del laboratorio). In generale, la produttività di questo saggio è insufficiente per la moderna scoperta di farmaci.
I test di fattibilità, che generalmente hanno una produttività molto più elevata, consentono ai ricercatori di aggirare questa limitazione, ma sono disponibili con avvertenze significative (vedi tabella 1). Questi metodi generalmente si suddividono in due gruppi. Un gruppo è composto da saggi colorimetrici basati sulla funzione degli enzimi redox cellulari. I substrati incolori o non fluorescenti vengono convertiti in prodotti vibranti quantificabili utilizzando uno spettrofotometro. Esempi classici includono sali di tetrazolio (MTT, WST-1, XTT, ecc.) e resazurina. Questa categoria include anche test luminescenti che utilizzano luciferina per valutare il livello ATP. Saggi di questo tipo hanno la limitazione sottostante che stanno misurando il metabolismo cellulare, che non è la vitalità cellulare di per sé. È abbastanza comune che le cellule diventino quiescenti in condizioni avverse, ma mantengano comunque la capacità didividere 3,4,5. Ad esempio, le cellule staminali tumorali sono spesso relativamente metabolicamente quiescenti6,7,8,9e sono probabilmente difficili da saggiare utilizzando queste tecniche. Anche l’efficacia dei trattamenti che danneggiano la funzione mitocondriale, come la maggior parte dei mitocani, è probabile che sia significativamente sopravvalutata.
Una metodologia alternativa sfrutta le proprietà chimiche di varie sostanze che consentono loro di attraversare o meno membrane biologiche. Un esempio sono le macchie nucleari come SYTOX o propidium iodide (PI). Questa categoria comprende anche saggi simili nel concetto ma diversi nella funzione, come il saggio lattato deidrogenasi (LDH), che misura il rilascio di LDH nell’ambiente extracellulare come indicatore della necrosi cellulare (Figura 1, Tabella 1). Questi test sono più in grado di distinguere tra cellule metabolicamente inattive e morte.
| Saggio/colorante | Tipi di morte cellulare rilevati | Attrezzature necessarie | Caratteristiche principali |
| MTT, CKK-8, Alamar Blue (resazurina) | Apoptosi/Necrosi | Spettrofotometro | Economico, rapido; test dell’endpoint; dipende dall’attività degli enzimi (esclusivamente mitocondriale in caso di MTT) e non discrimina tra i modi di morte cellulare1,10 |
| Versione LDH | Necrosi | Spettrofotometro | Rapido, indipendente dall’attività degli enzimi mitocondriali; costoso per i test ad alta produttività; rileva cellule necrotiche con membrana plasmatica compromessa11,12 |
| Trypan Blue (TB) | Apoptosi/Necrosi | Microscopio | Impermeente cellulare; non discrimina tra le modalità di morte cellulare; laborioso e non adatto per lo screening ad alta produttività; più difficile da usare con le cellule aderenti; soggetto a giudizio soggettivo dell’utente, ma è considerato il metodo standard di misurazione della vitalità cellulare13 |
| Arancia acridina (AO) | Apoptosi/Necrosi/ | Microscopio a fluorescenza | Un colorante acido nucleico con proprietà spettrali uniche, può distinguere tra apoptosi e necrosi/necrotosi14 |
| Necroptosi | |||
| Hoechst 33342 | Apoptosi | Microscopio a fluorescenza o citometro a flusso | Permeabile alle cellule; inappropriato da solo per monitorare la morte cellulare; utile per la co-colorazione; può essere usato per valutare la condensazione della cromatina e la frammentazione dei nuclei nell’apoptosi precoce; può essere abbinato allo ioduro di propidio per distinguere l’apoptosi dallanecrosi 15,16 |
| Ioduro di propidio (PI) | Apoptosi tardiva/Necrosi | Microscopio a fluorescenza o citometro a flusso | Intercalatore impermeante cellulare; rileva sia l’apoptosi tardiva che i modi di necrosi della mortecellulare 17. Tossico e permeabile dopo lunghe incubazioni per18 |
La tabella 1. Lista di test di citotossicità. I test di citotossicità, alcuni dei quali sono stati utilizzati in questo studio, elencati insieme alla breve descrizione delle loro caratteristiche chiave.
Recenti studi hanno dimostrato che il metabolismo mitocondriale è alterato in alcuni tumori19,20,21,22,23,24,25. Ad esempio, le leucemie mieloidi acute (AML) hanno dimostrato di aregolare la loro massa mitocondriale, il contenuto di MTDNA e la respirazione mitocondriale per soddisfare il loro fabbisognoenergetico 19,26,27. D’altra parte, alcuni tumori solidi sono caratterizzati da disfunzione mitocondriale, o meglio “riprogrammazione metabolica”, come la deregolamentazione delle proteine mitocondriali coinvolte in OXPHOS o la diminuzione del contenuto di mtDNA, che è stata associata all’invasività tumorale, al potenziale metastatico e alla resistenza ai farmaci che inducono l’apoptosi28,29. Inoltre, recentemente, c’è stato un maggiore interesse nell’uso di composti meccanisticamente diversi che influenzano la funzione mitocondriale (generalmente chiamata mitocani30), come potenziali terapie per particolari tumori. Questi farmaci prendono di mira la sintesi di ATP, il DNA mitocondriale, OXPHOS e la produzione di ROS, nonché proteine pro-apoptotiche e anti-apoptotiche associate ai mitocondri30,31. Diversi studi hanno dimostrato che questo approccio ha una promessasignificativa 19,32,33,34. Tuttavia, queste deviazioni metaboliche nella biologia delle cellule tumorali o nei trattamenti mirati ai mitocondri possono influenzare significativamente i test di vitalità convenzionali basati sulla funzionalità mitocondriale.
Qui viene descritto un protocollo ottimizzato per un saggio differenziale di colorazione nucleare. Il protocollo consente una determinazione rapida e accurata della citotossicità dei mitocani o delle loro combinazioni con altri composti. Hoechst 33342 è un colorante nucleare permeante alle cellule che attraversa facilmente le membrane cellulari per macchiare il DNA, permettendo di ottenere il conteggio totale delle cellule. Co-colorazione con PI, che entra solo nei nuclei di cellule morte, la proporzione di cellule viventi (solo Hoechst) e morte (macchiate con entrambe) cellule può essere determinata con precisione. Questo protocollo affina il saggiopubblicato 35 aggiungendo un passo per l’ottimizzazione della concentrazione di colorante (incrociando i risultati con metodo blu trypan ortogonale) e la centrifugazione della piastra prima dell’imaging. Poiché molte linee cellulari sono semi-aderenti o sospese, la centrifugazione aumenta la proporzione di celle che vengono immagini e migliora fortemente la precisione. Il saggio ha diversi vantaggi, tra cui quella colorazione non richiede la rimozione dei supporti o il lavaggio. La miscela di coloranti è anche economica, facile da preparare e compatibile con i sistemi di pipettazione multicanale / robotica.
Dopo che le celle sono state macchiate, vengono immagini con un microscopio automatizzato. Questo ha l’ulteriore vantaggio di creare una registrazione permanente delle immagini che possono essere ri-analizzate in seguito e gli effetti di particolari composti possono essere rivalutazioneti mediante l’ispezione visiva delle immagini acquisite. Una volta ottenute le immagini, le celle possono essere conteggiate manualmente o utilizzando uno dei diversi pacchetti software, inclusi sia software gratuiti (ad esempio, ImageJ, CellProfiler, ecc.) che commerciali (ad esempio, Metamorph, Gen5, ecc.). Il conteggio automatico delle celle è generalmente preferibile poiché le pipeline automatizzate di conteggio delle celle adeguatamente sviluppate sono più accurate e meno distorte rispetto al conteggio manuale. Ignorano anche in modo più efficace i detriti cellulari o i complessi insolubili. Lo sviluppo di queste tubazioni è generalmente semplice ed è semplificato dall’efficienza delle macchie utilizzate. L’output è quantitativo poiché il numero effettivo di celle morte viene calcolato automaticamente rispetto al numero totale di celle e possono essere applicate soglie diverse per aumentare o diminuire il rigore delrilevamento 35. Per comodità, sono inclusi parametri ottimizzati per il conteggio delle celle che utilizzano il lettore multi-modalità Cytation 5 Cell Imaging compatibile con il software Gen5 v. 3.00.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sebbene il protocollo per il test di citotossicità Hoechst/PI sia robusto e richieda relativamente poco tempo pratico, ci sono diversi dettagli sperimentali che sono molto importanti per garantire risultati accurati. In primo luogo, è essenziale assicurarsi che la concentrazione di DMSO rimanga al di sotto dello 0,5% (v/v). È generalmente riconosciuto che l’esposizione a dosi anche basse di DMSO può alterare sostanzialmente la morfologia e l’attaccamento delle cellule e ritardare significativamente la progressione<su…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NVK, uno studioso CPRIT in Ricerca sul Cancro, ringrazia il Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT) per il suo generoso sostegno, la sovvenzione CPRIT RR150044. Questo lavoro è stato sostenuto anche dal Welch Foundation Research Grant C-1930 e dal National Institutes of Health R35 GM129294 assegnato alla NVK. I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e nell’analisi dei dati, nella decisione di pubblicare o preparare il manoscritto.
Materials
| 2-Deoxy-D-glucose/2-DG | Chem-Impex | 50-519-067 | |
| 3-bromo-pyruvate | Alfa Aesar | 1113-59-3 | |
| 96-Well plates | Greiner Bio-One | 655090 | Black or clear flat-bottomed 96-well plates |
| Alamar blue HS cell viability reagent (100mL) | Thermo Fisher | A50101 | |
| Countess II automated cell counter | Thermo Fisher | ||
| Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader | BioTek | ||
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | 62249 | 20 mM solution; final concentration 1:1,000 |
| HyClone fetal bovine serum | GE Healthcare | #25-514 | |
| m-chlorophenylhydrazone/CCCP | Sigma Aldrich | C2759 | |
| PBS tablets | Thermo Fisher | BP2944100 | 1 tablet + 200 mL of sterile water = 1x PBS solution |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X) | Gibco | 10378016 | |
| Pierce LDH assay kit | Thermo Fisher | 50-103-5952 | |
| Propidium Iodide | Thermo Fisher | 50-596-072 | Dry powder; stock 1 mg/mL in PBS; final concentration 5 µg/mL (leukemia cells), 1 µg/mL (normal PBMCs) |
| Rotenone | Ark Pharm | AK115691 | |
| RPMI-1640 Medium With L-glutamine and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture |
Sigma Aldrich | R8758-500ML | |
| Thiazolyl blue tetrazolium bromide | ACROS Organics | AC158990010 | |
| Trypan blue stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Cell lines | |||
| K562 | ATCC | CCL-243 | CML cell line |
| MOLM-13 | ATCC | AML cell line |
|
| MOLT-4 | ATCC | CRL-1582 | ALL cell line |
| OCI-AML2 | ATCC | AML cell line |
|
Referências
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