झिल्ली प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन विश्लेषण के लिए देशी सेल झिल्ली नैनोकण प्रणाली
Summary
यहां प्रस्तुत झिल्ली प्रोटीन की अल्पाधिकारी स्थिति के निर्धारण के लिए एक प्रोटोकॉल है जो इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ मिलकर एक देशी कोशिका झिल्ली नैनोपार्टिकल सिस्टम का उपयोग करता है।
Abstract
कोशिका झिल्ली प्रणालियों में प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन जैविक प्रक्रियाओं की एक विस्तृत श्रृंखला में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं- सेल-टू-सेल इंटरैक्शन से लेकर संकेत लेनदेन तक; जैविक प्रतिक्रिया के लिए पर्यावरण संकेतों को संवेदन से; मेटाबॉलिक रेगुलेशन से लेकर विकासात्मक नियंत्रण तक। झिल्ली प्रोटीन परिसरों के आणविक तंत्र को समझने और इन प्रोटीनों को मिलाना करने के लिए अत्यधिक विशिष्ट अणुओं के डिजाइन के लिए प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन की सटीक संरचनात्मक जानकारी महत्वपूर्ण है। प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन का पता लगाने और विश्लेषण के लिए वीवो और इन विट्रो दृष्टिकोणों में कई विकसित किए गए हैं। उनमें से संरचनात्मक जीव विज्ञान दृष्टिकोण अद्वितीय है कि यह परमाणु स्तर पर प्रोटीन प्रोटीन बातचीत की प्रत्यक्ष संरचनात्मक जानकारी प्रदान कर सकता है । हालांकि, वर्तमान झिल्ली प्रोटीन संरचनात्मक जीव विज्ञान अभी भी काफी हद तक डिटर्जेंट आधारित तरीकों तक ही सीमित है । डिटर्जेंट आधारित तरीकों की प्रमुख खामी यह है कि वे अक्सर डिटर्जेंट अणुओं द्वारा अपने मूल लिपिड बाइलेयर पर्यावरण को हटा दिए जाने के बाद झिल्ली प्रोटीन परिसरों को अलग या विकृत कर देते हैं। हम झिल्ली प्रोटीन संरचनात्मक जीव विज्ञान के लिए एक देशी कोशिका झिल्ली नैनोपार्टिकल प्रणाली विकसित कर रहे हैं। यहां, हम एसीआरबी की अल्पाधिकारी स्थिति के एक मामले के अध्ययन के साथ कोशिका झिल्ली पर प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन के विश्लेषण में इस प्रणाली के उपयोग को प्रदर्शित करते हैं।
Introduction
प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन (पीपीआई) पूरे जीव विज्ञान में निर्णायक भूमिका निभाते हैं, संरचना के रखरखाव और प्रोटीन के कार्य से लेकर पूरे सिस्टम के नियमन तक। पीपीआई कई अलग-अलग रूपों में आते हैं और उन्हें किस प्रकार की बातचीत के आधार पर वर्गीकृत किया जा सकता है। ऐसा ही एक वर्गीकरण होमोओलिमोमेरिक या हेट्रोलिगोमेमीरिक है, जो इस आधार पर है कि बातचीत समान उपइकाकारों या उपइकायों के रूप में कार्य करने वाले विभिन्न प्रोटीन के बीच है या नहीं। एक और वर्गीकरण बातचीत की ताकत पर आधारित है अगर बातचीत स्थिर परिसरों या क्षणिक जटिल राज्यों के गठन की ओर जाता है । प्रोटीन के बीच पीपीआई के बारे में संरचनात्मक जानकारी उस तंत्र को समझने में महत्वपूर्ण है जिसके द्वारा प्रोटीन अपने कार्य को पूरा करते हैं । यह अनुमान लगाया गया है कि 80% से अधिक प्रोटीन अपनी कार्यात्मक भूमिकाओं को पूरा करने के लिए जटिल गठन पर भरोसा करते हैं1. उचित सहज कार्य करने के लिए पीपीआई पर निर्भर पाए जाने वाले प्रोटीन के प्रतिशत को देखते हुए जीव विज्ञान में उनका महत्व आसानी से स्पष्ट है, फिर भी इन बातचीत में संलग्न प्रोटीन की ठीक से जांच करने में सक्षम होने के कारण प्रायोगिक रूप से निरीक्षण करने के लिए उपलब्ध तकनीकों में सीमाओं के कारण चुनौतीपूर्ण बना हुआ है जब प्रोटीन पीपीआई बना रहे हैं ।
शोर, झूठी सकारात्मक, और झूठी नकारात्मक है कि वर्तमान में उपलब्ध पीपीआई निर्धारण तकनीकों में से कई से प्राप्त कर रहे है की उच्च राशि के कारण कई प्रयोगात्मक निर्धारित PPIs के लिए परिणामों के बीच असहमति का एक उच्च डिग्री है । यह खमीर दो-हाइब्रिड (वाई2एच) प्रणाली, टैंडेम एफ़िनिटी शुद्धिकरण-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (टैप-एमएस) और फ्लोरेसेंस प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (एफईआरटी) के लिए विशेष रूप से ऐसा है, जो पीपीआईनिर्धारण2, 3,4,5,6,7के लिए सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले तीन तरीकों का प्रतिनिधित्व करता है। इसकी तुलना में, प्रोटीन संरचनात्मक जीव विज्ञान तकनीकों, जैसे परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर), एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम), का उपयोग प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन के बारे में उच्च-संकल्प संरचनात्मक जानकारी हासिल करने के लिए परमाणु स्तर तक किया जा सकता है और ब्याज के लक्षित प्रोटीन के लिए होने वाली बातचीत की प्रत्यक्ष दृश्य पुष्टि के लिए अनुमति देता है । वर्तमान में उपलब्ध गैर संरचना आधारित पीपीआई अनुसंधान तकनीकों का निर्धारण (जैसे, Y2H, TAP-MS, और FRET) के सभी इस क्षमता की कमी है और इसके अतिरिक्त प्रोटीन5के बीच कमजोर और क्षणिक बातचीत की पहचान करने में कठिनाई होने से पीड़ित हैं । लिपिड वातावरण के अतिरिक्त चर द्वारा लाई गई अतिरिक्त जटिलता के कारण झिल्ली प्रोटीन का अध्ययन करते समय इन कमियों को और बढ़ाया जाता है जो उचित क्वाटरेरी संरचना और हेट्रोमेरिक जटिल असेंबली के गठन को प्रभावित करता है।
झिल्ली प्रोटीन प्रोटेम का एक बड़ा हिस्सा बनाते हैं और सभी जीवित जीवों के भीतर उचित कोशिका कार्य में कई महत्वपूर्ण भूमिकाएं निभाने के लिए जाने जाते हैं। इस तथ्य के बावजूद कि झिल्ली प्रोटीन मानव जीनोम का 27% बनाने का अनुमान है और सभी वर्तमान दवा लक्ष्यों का ~ 60% है, झिल्ली प्रोटीन के लिए हल किए गए मॉडलों की संख्या में एक बड़ी विसंगति है जो सभी प्रकाशित प्रोटीन संरचनाओं का केवल ~ 2.2% है8,9,10। संरचनात्मक जानकारी की उपलब्धता में विसंगति का प्राथमिक कारण झिल्ली प्रोटीन के आंतरिक गुणों में निहित है। उनकी खराब घुलनशीलता के कारण, देशी संरचना और कार्य को बनाए रखने के लिए लिपिड वातावरण के साथ बातचीत पर निर्भरता, और लिपिड झिल्ली के विभिन्न शारीरिक गुण, झिल्ली प्रोटीन उनका अध्ययन करने के लिए संरचनात्मक जीव विज्ञान तकनीकों को लागू करते समय एक पर्याप्त समस्या का प्रतिनिधित्व करते रहते हैं। इन आंतरिक गुणों में से, सटीक संरचनात्मक जानकारी प्राप्त करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण उनके लिए अपने प्राकृतिक लिपिड वातावरण के साथ बातचीत करने की आवश्यकता है ताकि वे अपनी मूल संरचना और कार्य को बनाए रख सकें। लिपिड वातावरण झिल्ली प्रोटीन की संरचना और कार्य का इतना अभिन्न हिस्सा है कि झिल्ली की अवधारणा (झिल्ली और प्रोटीन शब्दों का संयोजन) झिल्ली-प्रोटीन संरचना और कार्य11की मौलिक इकाई के रूप में प्रस्तावित किया गया है। लिपिड-प्रोटीन इंटरैक्शन के महत्व के बावजूद वर्तमान में उपलब्ध संरचना आधारित पीपीआई निर्धारण तकनीकों के लिए अक्सर यह आवश्यक होता है कि अध्ययन किए जा रहे प्रोटीन घुलनशील हों या डिटर्जेंट के साथ घुलनशील हों । कठोर डिटर्जेंट के संपर्क में प्रोटीन को विकृत कर सकते हैं या परिसीमन के कारण झूठे सकारात्मक और नकारात्मक पैदा हो सकते हैं, जो एकत्रीकरण, प्रोटीन के विकृतीकरण, गैर-सहसंयोजक बातचीत के विघटन और कृत्रिम अल्पाहारीय राज्यों के गठन को प्रेरित कर सकते हैं। झिल्ली प्रोटीन की देशी ओलिगोमेरिक स्थिति के सटीक निर्धारण के लिए एक प्राकृतिक लिपिड वातावरण को बनाए रखने की आवश्यकता के कारण हमने पहले रिपोर्ट किए गए स्टायरीन पुरुषीय अम्लीय लिपिड कणों (SMALP)13 विधि के आधार पर एक देशी सेल झिल्ली नैनोकण प्रणाली (एनसीएमएन)12 विकसित किया है।
SMALP झिल्ली प्रोटीन निकालने और घुलनशील करने के लिए एक झिल्ली सक्रिय बहुलक के रूप में स्टायरीन मलिक एसिड कोपॉलिमर का उपयोग करता है। पॉली (स्टायरीन-सह-मलिक एसिड) (एसएमए) एक अद्वितीय एम्फीफिलिक बहुलक है जो इसके हाइड्रोफोबिक स्टायरीन मॉलिसिटी और हाइड्रोफिलिक मलिक एसिड मोइटी का बिल्कुल विरोध करने के कारण है। यह पीएच-निर्भर तंत्र14में कोशिका झिल्ली को सोखने, अस्थिर करने और बाधित करके नैनोकणों का निर्माण करता है। SMA की यह कार्यात्मक गतिविधि है जो इसे झिल्ली प्रोटीन निष्कर्षण और घुलनशीलता के लिए एक डिटर्जेंट मुक्त प्रणाली के रूप में उपयोग करने की अनुमति देता है । एनसीएमएन प्रणाली कई पहलुओं में SMALP प्रणाली से अलग है। एनसीएमएन प्रणाली की सबसे अनूठी विशेषता यह है कि इसमें एक झिल्ली सक्रिय बहुलक पुस्तकालय है जिसमें कई पॉलीमर हैं जिनमें अद्वितीय गुण होते हैं जो उन्हें कई अलग-अलग झिल्ली प्रोटीन के अलगाव के लिए उपयुक्त बनाते हैं जिन्हें स्थिरता और देशी कामकाज के लिए विभिन्न परिस्थितियों की आवश्यकता होती है। नैनोकणों को तैयार करने की बात आती है तो एसएमपी विधि की तुलना में एनसीएमएन प्रणाली में भी अलग-अलग प्रोटोकॉल होते हैं। ऐसा ही एक उदाहरण यह है कि एनसीएमएन उच्च-संकल्प संरचना निर्धारण के लिए एकल-चरण निकल आत्मीयता कॉलम शुद्धि का उपयोग करते हैं; एनसीएमएनएस प्रोटोकॉल की तुलना करते समय इन विभिन्न प्रोटोकॉलों का प्रभाव देखा जा सकता है, जिसने 3.2 और 3.0 Å क्रायो-ईएम एसीआरबी संरचनाएं उत्पन्न कीं, इसी तरह के अध्ययन के साथ SMALP विधि का उपयोग करके, जिसके परिणामस्वरूप 8.8 Å संकल्प12,15पर क्रायो-ईएम एसीआरबी संरचना हुई। एनसीएमएन प्रणाली की ये अनूठी विशेषताएं पहले से स्थापित SMALP विधि पर किए गए सुधार हैं और इसे पीपीआई के अध्ययन के लिए एक आदर्श उम्मीदवार बनाते हैं।
मल्टीड्रग एफ्लक्स ट्रांसपोर्टर एसीआरबी ई. कोलाई12में कार्यात्मक समोसे के रूप में मौजूद है। एक उत्परिवर्तनीय विश्लेषण ने सुझाव दिया कि एक एकल P223G पॉइंट उत्परिवर्तन, जो एक लूप पर स्थित है जो एसीआरबी ट्राइमर की स्थिरता के लिए जिम्मेदार है, ट्राइमर राज्य को अस्थिर करता है और डिटर्जेंट डीडीएम के साथ तैयार होने पर एक एसीआरबी मोनोमर पैदा करता है, जिसे देशी नीले जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस16के साथ पता लगाया जा सकता है। हालांकि, AcrB-P223G उत्परिवर्ती के FRET विश्लेषण का सुझाव दिया है कि जब देशी सेल झिल्ली लिपिड bilayer वातावरण में, उत्परिवर्ती AcrB-P223G के बहुमत अभी भी एक trimer के रूप में मौजूद है और दोनों जंगली प्रकार AcrB और AcrB-P223G के लिए अभिव्यक्ति का स्तर समान हैं । फिर भी FRET विश्लेषण परिणामों के बावजूद, उत्परिवर्ती ट्रांसपोर्टर के लिए एक गतिविधि परख से पता चला है कि गतिविधि नाटकीय रूप से कम हो गई जब जंगली प्रकार16की तुलना में । यद्यपि प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन के विश्लेषण के लिए FRET तकनीक का उपयोग लोकप्रिय रूप से किया गया है, अनुसंधान से पता चला है कि यह अक्सर झूठी सकारात्मक17, 18,19,20दे सकता है।
हाल ही में, एसीआरबी ट्रिमर की उच्च-रिज़ॉल्यूशन क्रायो-ईएम संरचनाएं निर्धारित की गई थीं, जिन्होंने एनसीएमएनएस12के उपयोग के माध्यम से अपने संबद्ध देशी कोशिका झिल्ली लिपिड बाइलेयर के साथ एसीआरबी की बातचीत दिखाई। सैद्धांतिक रूप से, एनसीएमएन का उपयोग देशी कोशिका झिल्ली पर पाए जाने वाले प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन के विश्लेषण के लिए आसानी से किया जा सकता है। इस प्रणाली के परीक्षण में, देशी कोशिका झिल्ली नैनोकणों और नकारात्मक धुंधला इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के उपयोग के साथ सीधे AcrB-P223G की अल्पाधिकारी स्थिति का निरीक्षण करने के लिए प्रयोग किए गए थे । जंगली प्रकार AcrB नैनोकणों के साथ तुलना करने के लिए, हम एक ही झिल्ली सक्रिय बहुलक (SMA2000 हमारी प्रयोगशाला में बनाया है, जो NCMNP1-1 NCMN पुस्तकालय में के रूप में अनुक्रमित है) AcrB और वैकल्पिक बहुलक के उच्च संकल्प क्रायो-ईएम संरचना निर्धारण के लिए इस्तेमाल किया NCMNs पुस्तकालय12में पाया इस्तेमाल किया । पहले रिपोर्ट किए गए परिणामों के आधार पर, यह उम्मीद की गई थी कि AcrB-P223G उत्परिवर्ती का बहुमत ट्राइमेरिक देशी कोशिका झिल्ली नैनोकणों21के रूप में मौजूद होगा। हालांकि, नमूने में कोई एसीआरबी ट्रिमर्स मौजूद नहीं पाया गया, जैसे कि जंगली प्रकार के AcrB के साथ मनाया गया था। यह पता चलता है AcrB-P223G के बहुमत देशी कोशिका झिल्ली पर ट्रिमर फार्म के रूप में पहले से सुझाव नहीं है ।
यहां हम एनसीएमएन का उपयोग करके जंगली प्रकार ई. कोलाई एसीआरबी की तुलना में उत्परिवर्ती ई. कोलाई AcrB-P223G के विस्तृत विश्लेषण की रिपोर्ट करते हैं। एसीआरबी के इस केस स्टडी से पता चलता है कि एनसीएमएन प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन एनालिसिस के लिए एक अच्छी प्रणाली है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
झिल्ली प्रोटीन की संरचना और कार्य की अखंडता के लिए प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन महत्वपूर्ण हैं। प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन की जांच के लिए कई दृष्टिकोण विकसित किए गए हैं। घुलनशील प्रोटीन की तुलना में, झि…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध को वीसीयू स्टार्टअप फंड (वाईजी को) और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ के नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ जनरल मेडिकल साइंसेज द्वारा पुरस्कार संख्या R01GM132329 (वाईजी को) के तहत समर्थित किया गया था । सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व करता है । हम वीडियो रिकॉर्डिंग के लिए उनके उदार समर्थन के लिए मोंटसराट सैमसो और केविन मैकरॉबर्ट्स को धन्यवाद देते हैं।
Materials
| Chemicals | |||
| 30% Acrylamide/BIS SOL (37.5:1) | Bio-Rad | 161-0158 | |
| 4x Laemmli Sample Buffer (Loading Buffer) | Bio-Rad | 1610747 | |
| Acetic Acid Glacial | ThermoFisher Scientific | A38S-212 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Bio-Rad | 161-0700 | |
| Chloramphenicol | Goldbio | C-105-5 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 protein stain powder | Bio-Rad | 161-0400 | |
| DTT (Dithiothreitol) (> 99% pure) Protease free | Goldbio | DTT10 | |
| Glycerol | ThermoFisher Scientific | G33-4 | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | BP310-1 | |
| Imidazole | Affymetrix | 17525 1 KG | |
| IPTG | Goldbio | I2481C100 | |
| Kanamycin | Goldbio | K-120-25 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | ThermoFisher Scientific | AA3622636 | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | A412-4 | |
| N,N-dimethylethylenediamine (EDTA) | Merck | 8.03779.0100 | |
| NCMNS-P5-2 | Not commercially available yet | Submit request for obtaining to corresponding author | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standard | Bio-Rad | 161-0374 | |
| SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) | Bio-Rad | 161-0301 | |
| SMA2000 | Cray Valley | Submit request for obtaining to corresponding author | |
| Sodium Chloride | ThermoFisher Scientific | S271-10 | |
| TCEP-HCl | Goldbio | TCEP25 | |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| Terrific Broth Media | Affymetrix | 75856 1 KG | |
| Tris Base | Bio-Rad | 161-0719 | |
| Uranyl Acetate | Ambinter | Amb22348393 | |
| Equipment | |||
| Avanti J-26S XPI | Beckman Coulter | B14538 | |
| Avanti JXN-30 | Beckman Coulter | B34193 | |
| Carbon Electron Microscope Grids (10 nm) | Electron Microscopy Sciences | CF300-Cu-TH | |
| Con-Torque Tissue Homogenizer | Eberbach | E7265 | |
| Corning LSE Mini Microcentrifuge | ThermoFisher Scientific | 07-203-954 | |
| EmulsiFlex-C3 | Avestin | ||
| Fraction Collector F9-R | GE Healthcare Life Sciences | 29003875 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 165-8004 | |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter | PN LL-IM-12AB | |
| PELCO easiGlow Glow Discharge Cleaning System | Ted Pella | 91000S-230 | |
| Potter-Elvehjem Safe Grind Tissue Grinder | Wheaton | 358013 | |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 164-5050 | |
| Razel R99-E Variable Speed Syringe Pump | Razel Scientific Instruments | ||
| Superdex 200 Increase 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 28990944 | |
| Tecnai F20 200kV | FEI | ||
| Type 70 Ti Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | ||
| General Materials | |||
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 05-408-129 | |
| 4 ml Amicon Ultra-4 30 kDa | Millipore Sigma | UFC803024 | |
| AKTA pure 25 L1 FPLC | GE Healthcare Life Sciences | 29018225 | |
| BL21(DE3)pLysS Cells | ThermoFisher Scientific | C606003 | |
| Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-49A | |
| HisTrap HP 5 ml Column | GE Healthcare Life Sciences | 17524802 | |
| pET-24a | EMD Biosciences | 69749-3 |
Referências
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