Native Cell Membrane Nanopartikler System for Membran Protein-Protein Interaktion Analyse
Summary
Præsenteret her er en protokol til bestemmelse af oligomerisk tilstand af membranproteiner, der bruger et indfødt cellemembran nanopartikelsystem i forbindelse med elektronmikroskopi.
Abstract
Proteinproteininteraktioner i cellemembransystemer spiller afgørende roller i en lang række biologiske processer – fra celle-til-celle-interaktioner til signaltransduktion; fra at fornemme miljøsignaler til biologisk respons fra metabolisk regulering til udviklingskontrol. Nøjagtige strukturelle oplysninger om proteinproteininteraktioner er afgørende for at forstå de molekylære mekanismer i membranproteinkomplekser og for udformningen af meget specifikke molekyler til at modulere disse proteiner. Der er udviklet mange in vivo- og in vitro-metoder til påvisning og analyse af proteinproteininteraktioner. Blandt dem er den strukturelle biologitilgang unik, fordi den kan give direkte strukturel information om proteinproteininteraktioner på atomniveau. Den nuværende strukturelle membranproteinbiologi er dog stadig i vid udstrækning begrænset til vaskemiddelbaserede metoder. Den største ulempe ved vaskemiddelbaserede metoder er, at de ofte dissocierer eller denaturerer membranproteinkomplekser, når deres oprindelige lipid bilayer-miljø fjernes af vaskemiddelmolekyler. Vi har udviklet en indfødt cellemembran nanopartikel system til membran protein strukturelle biologi. Her demonstrerer vi brugen af dette system i analysen af proteinproteininteraktioner på cellemembranen med et casestudie af AcrB’s oligomeriske tilstand.
Introduction
Proteinproteininteraktioner (PPI) spiller centrale roller i hele biologien, fra vedligeholdelse af proteiners struktur og funktion til regulering af hele systemer. PPI findes i mange forskellige former og kan kategoriseres ud fra, hvilke typer interaktioner de danner. En sådan kategorisering er homooligomerisk eller heterooligomerisk, baseret på, om interaktionerne er mellem identiske underenheder eller forskellige proteiner, der fungerer som underenheder. En anden kategorisering er baseret på styrken af interaktionen, hvis interaktionerne fører til dannelsen af stabile komplekser eller forbigående komplekse tilstande. Strukturelle oplysninger om PPI mellem proteiner er afgørende for at forstå den mekanisme, hvormed proteiner udfører deres funktion. Det er blevet anslået , at over 80% af proteinerne er afhængige af kompleks dannelse for at udføre deres funktionelle roller1. I betragtning af den procentdel af proteiner, der observeres at være afhængige af PPI for korrekt medfødt funktion, er deres betydning i biologi let tydelig, men det er let at kunne undersøge de proteiner, der deltager i disse interaktioner, korrekt på grund af begrænsninger i de teknikker, der er tilgængelige for eksperimentelt at observere, når proteiner danner PPI.
Der er en høj grad af uenighed mellem resultaterne for mange eksperimentelt bestemte PPI’er på grund af den høje mængde støj, falske positiver og falske negativer, der stammer fra mange af de aktuelt tilgængelige PPI-bestemmelsesteknikker. Dette gælder især gær to-hybrid (Y2H) system, tandem affinitet rensning-masse spektrometri (TAP-MS), og fluorescens resonans energioverførsel (FRET), som repræsenterer tre af de mest anvendte metoder til PPI bestemmelse2,3,4,5,6,7. Til sammenligning kan proteinstrukturelle biologiteknikker, såsom nuklear magnetisk resonans (NMR), røntgenkrystallografi og elektronmikroskopi (EM), bruges til at få strukturelle oplysninger i høj opløsning om proteinproteininteraktioner ned til atomniveau og give mulighed for direkte visuel bekræftelse af de interaktioner, der opstår for et målprotein af interesse. Alle de aktuelt tilgængelige ikke-strukturbaserede PPI-afgørende forskningsteknikker (f.eks. Y2H, TAP-MS og FRET) mangler denne evne og lider desuden af at have svært ved at identificere svage og forbigående interaktioner mellem proteiner5. Disse mangler forstærkes yderligere, når man studerer membranproteiner på grund af den ekstra kompleksitet, der er forårsaget af den ekstra variabel i lipidmiljøet, der påvirker dannelsen af korrekt kvartær struktur og heteromerisk kompleks samling.
Membranproteiner udgør en stor del af proteomet og er kendt for at spille mange afgørende roller i korrekt cellefunktion inden for alle levende organismer. På trods af at membranproteiner anslås at udgøre 27% af det menneskelige genom og udgør ~ 60% af alle nuværende lægemiddelmål, er der en stor anomali i antallet af løste modeller for membranproteiner, der kun udgør ~ 2,2% af alle offentliggjorte proteinstrukturer8,9,10. Den primære årsag til uoverensstemmelsen i tilgængeligheden af strukturelle oplysninger ligger i membranproteinernes iboende egenskaber selv. På grund af deres dårlige opløselighed, afhængighed af interaktioner med et lipidmiljø til opretholdelse af indfødt struktur og funktion og forskellige fysiskkemiske egenskaber af lipidmembranen selv, udgør membranproteiner fortsat et betydeligt problem, når de implementerer strukturelle biologiteknikker til at studere dem. Af disse iboende egenskaber er det vigtigste for at opnå nøjagtige strukturelle oplysninger kravet om at have interaktioner med deres naturlige lipidmiljø for dem at opretholde deres oprindelige struktur og funktion. Lipidmiljøet er en så integreret del af membranproteinernes struktur og funktion, at begrebet memtein (en kombination af ordene membran og protein) er blevet foreslået som den grundlæggende enhed af membranproteinstruktur og funktion11. På trods af vigtigheden af lipidproteininteraktioner kræver de nuværende strukturbaserede PPI-bestemmelsesteknikker ofte, at de proteiner, der undersøges, opløses eller opløses med vaskemidler. Eksponering for barske vaskemidler kan denaturere proteinerne eller forårsage falske positiver og negativer på grund af delipidation, som kan fremkalde sammenlægning, denaturering af protein, dissociation af ikke-kovalente interaktioner og dannelse af kunstige oligomeriske tilstande. På grund af nødvendigheden af at opretholde et naturligt lipidmiljø til nøjagtig bestemmelse af den oprindelige oligomeriske tilstand af membranproteiner har vi udviklet et native cellmembran nanopartikler system (NCMNs)12 baseret på den tidligere rapporterede Styrene Maleic Acid Lipid Particles (SMALP)13 metode.
SMALP bruger styren malesyre copolymer som en membranaktiv polymer til at udvinde og opløse membranproteiner. Poly(Styrene-co-Maleic Acid) (SMA) er en unik amphifil polymer på grund af dens hydrofobe styren moiety og diametralt modsatte hydrofile maleinsyre moiety. Det danner nanopartikler ved adsorbing til, destabiliserende, og forstyrre cellemembranen i en pH-afhængig mekanisme14. Denne funktionelle aktivitet af SMA er det, der gør det muligt at bruge det som et vaskemiddelfrit system til membranproteinudvinding og opløselighed. NCMN-systemet adskiller sig fra SMALP-systemet i flere henseender. Det mest unikke træk ved NCMN-systemet er, at det har et membranaktivt polymerbibliotek med et væld af polymerer, der har unikke egenskaber, der gør dem egnede til isolering af mange forskellige membranproteiner, der kræver forskellige betingelser for stabilitet og indfødt funktion. NCMN-systemet har også forskellige protokoller sammenlignet med SMALP-metoden, når det kommer til forberedelse af nanopartiklerne. Et sådant eksempel er, at NCMN’er bruger en enkelt-trins nikkel affinitet kolonne rensning for høj opløsning struktur bestemmelse; effekten af disse forskellige protokoller kan observeres ved sammenligning af NCMN-protokollen, som genererede 3.2 og 3.0 Å cryo-EM AcrB-strukturer, med en lignende undersøgelse ved hjælp af SMALP-metoden, som resulterede i en kryo-EM AcrB-struktur ved en 8,8 Å opløsning12,15. Disse unikke træk ved NCMN-systemet er de forbedringer, der er foretaget på den tidligere etablerede SMALP-metode, og gør det til en ideel kandidat til studiet af PPI.
Multidrug efflux transportøren AcrB findes som funktionel homotrimer i E. coli12. En mutagen analyse antydede, at en enkelt P223G-punktmutation, der er placeret på en løkke, der er ansvarlig for stabiliteten af AcrB-trimeren, destabiliserer trimertilstanden og giver en AcrB monomer, når den fremstilles med vaskemidlet DDM, som kunne påvises med indfødt blå gel elektrophoresis16. Fret-analysen af AcrB-P223G-mutanten antydede imidlertid, at når man var i det oprindelige cellemembran lipid bilayermiljø, eksisterede størstedelen af mutant AcrB-P223G stadig som trimer, og at udtryksniveauerne for både vildtype AcrB og AcrB-P223G er ens. Men på trods af FRET-analyseresultaterne viste en aktivitetsanalyse for den mutante transportør, at aktiviteten faldt dramatisk sammenlignet med den vilde type16. Selvom FRET-teknologi er blevet populært brugt til analyse af proteinproteininteraktioner, har forskning vist, at den ofte kan give falske positiver17,18,19,20.
For nylig blev høj opløsning kryo-EM strukturer AcrB trimer bestemmes, som viste samspillet mellem AcrB med dens tilknyttede indfødte cellemembran lipid bilayer ved hjælp af NCMN’er12. I princippet kan NCMN’erne let anvendes til analyse af proteinproteininteraktioner, der findes på den indfødte cellemembran. I en test af dette system blev der udført eksperimenter for direkte at observere den oligomeriske tilstand af AcrB-P223G ved brug af indfødte cellemembran nanopartikler og negativ farvning af elektronmikroskopi. For at sammenligne med den vilde type AcrB nanopartikler brugte vi den samme membranaktive polymer (SMA2000 lavet i vores laboratorium, som er indekseret som NCMNP1-1 i NCMN-biblioteket), der bruges til kryo-EM-strukturbestemmelse i høj opløsning af AcrB og alternative polymerer, der findes i NCMNs-biblioteket12. Baseret på de tidligere rapporterede resultater forventedes det, at størstedelen af AcrB-P223G-mutanten ville eksistere i form af trimeriske indfødte cellemembran nanopartikler21. Der blev imidlertid ikke fundet AcrB-trimere i stikprøven, som dem, der blev observeret med den vilde type AcrB. Dette tyder på, at størstedelen af AcrB-P223G ikke danner trimers på den indfødte cellemembran som tidligere foreslået.
Her rapporterer vi en detaljeret analyse af mutanten E. coli AcrB-P223G i en sammenligning med den vilde type E. coli AcrB ved hjælp af NCMN’erne. Dette casestudie af AcrB antyder, at NCMN’er er et godt system til protein-proteininteraktionsanalyse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Proteinproteininteraktioner er vigtige for integriteten af membranproteinernes struktur og funktion. Mange tilgange er blevet udviklet til at undersøge protein-protein interaktioner. Sammenlignet med opløselige proteiner er membranproteiner og deres PPI vanskeligere at studere på grund af membraneproteinernes unikke iboende egenskaber. Denne vanskelighed hovedsageligt kommer fra kravet om membran proteiner, der skal indlejres i en indfødt lipid bilayer miljø for strukturel stabilitet og funktionalitet. Dette bliver …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskning blev støttet af VCU start fond (til YG) og National Institute of General Medical Sciences af National Institutes of Health under Award Number R01GM132329 (til Y.G.) Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de nationale sundhedsinstitutters officielle synspunkter. Vi takker Montserrat Samso og Kevin McRoberts for deres generøse støtte til videooptagelse.
Materials
| Chemicals | |||
| 30% Acrylamide/BIS SOL (37.5:1) | Bio-Rad | 161-0158 | |
| 4x Laemmli Sample Buffer (Loading Buffer) | Bio-Rad | 1610747 | |
| Acetic Acid Glacial | ThermoFisher Scientific | A38S-212 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Bio-Rad | 161-0700 | |
| Chloramphenicol | Goldbio | C-105-5 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 protein stain powder | Bio-Rad | 161-0400 | |
| DTT (Dithiothreitol) (> 99% pure) Protease free | Goldbio | DTT10 | |
| Glycerol | ThermoFisher Scientific | G33-4 | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | BP310-1 | |
| Imidazole | Affymetrix | 17525 1 KG | |
| IPTG | Goldbio | I2481C100 | |
| Kanamycin | Goldbio | K-120-25 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | ThermoFisher Scientific | AA3622636 | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | A412-4 | |
| N,N-dimethylethylenediamine (EDTA) | Merck | 8.03779.0100 | |
| NCMNS-P5-2 | Not commercially available yet | Submit request for obtaining to corresponding author | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standard | Bio-Rad | 161-0374 | |
| SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) | Bio-Rad | 161-0301 | |
| SMA2000 | Cray Valley | Submit request for obtaining to corresponding author | |
| Sodium Chloride | ThermoFisher Scientific | S271-10 | |
| TCEP-HCl | Goldbio | TCEP25 | |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| Terrific Broth Media | Affymetrix | 75856 1 KG | |
| Tris Base | Bio-Rad | 161-0719 | |
| Uranyl Acetate | Ambinter | Amb22348393 | |
| Equipment | |||
| Avanti J-26S XPI | Beckman Coulter | B14538 | |
| Avanti JXN-30 | Beckman Coulter | B34193 | |
| Carbon Electron Microscope Grids (10 nm) | Electron Microscopy Sciences | CF300-Cu-TH | |
| Con-Torque Tissue Homogenizer | Eberbach | E7265 | |
| Corning LSE Mini Microcentrifuge | ThermoFisher Scientific | 07-203-954 | |
| EmulsiFlex-C3 | Avestin | ||
| Fraction Collector F9-R | GE Healthcare Life Sciences | 29003875 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 165-8004 | |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter | PN LL-IM-12AB | |
| PELCO easiGlow Glow Discharge Cleaning System | Ted Pella | 91000S-230 | |
| Potter-Elvehjem Safe Grind Tissue Grinder | Wheaton | 358013 | |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 164-5050 | |
| Razel R99-E Variable Speed Syringe Pump | Razel Scientific Instruments | ||
| Superdex 200 Increase 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 28990944 | |
| Tecnai F20 200kV | FEI | ||
| Type 70 Ti Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | ||
| General Materials | |||
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 05-408-129 | |
| 4 ml Amicon Ultra-4 30 kDa | Millipore Sigma | UFC803024 | |
| AKTA pure 25 L1 FPLC | GE Healthcare Life Sciences | 29018225 | |
| BL21(DE3)pLysS Cells | ThermoFisher Scientific | C606003 | |
| Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-49A | |
| HisTrap HP 5 ml Column | GE Healthcare Life Sciences | 17524802 | |
| pET-24a | EMD Biosciences | 69749-3 |
Referências
- Berggard, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).
- Huang, H., Bader, J. S. Precision and recall estimates for two-hybrid screens. Bioinformatics. 25 (3), 372-378 (2009).
- Serebriiskii, I. G., Golemis, E. A. Two-hybrid system and false positives. Approaches to detection and elimination. Methods in Molecular Biology. 177, 123-134 (2001).
- Gingras, A. C., Gstaiger, M., Raught, B., Aebersold, R. Analysis of protein complexes using mass spectrometry. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 8 (8), 645-654 (2007).
- Ngounou Wetie, A. G., et al. Investigation of stable and transient protein-protein interactions: Past, present, and future. Proteomics. 13 (3-4), 538-557 (2013).
- Schaufele, F. Maximizing the quantitative accuracy and reproducibility of Forster resonance energy transfer measurement for screening by high throughput widefield microscopy. Methods. 66 (2), 188-199 (2014).
- Berney, C., Danuser, G. FRET or no FRET: a quantitative comparison. Biophysical Journal. 84 (6), 3992-4010 (2003).
- Almen, M. S., Nordstrom, K. J., Fredriksson, R., Schioth, H. B. Mapping the human membrane proteome: a majority of the human membrane proteins can be classified according to function and evolutionary origin. BMC Biology. 7, 50 (2009).
- Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. How many drug targets are there. Nature Reviews in Drug Discovery. 5 (12), 993-996 (2006).
- Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Research. 28 (1), 235-242 (2000).
- Overduin, M., Esmaili, M. Memtein: The fundamental unit of membrane-protein structure and function. Chemistry and Physics of Lipids. 218, 73-84 (2019).
- Qiu, W., et al. Structure and activity of lipid bilayer within a membrane-protein transporter. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 115 (51), 12985-12990 (2018).
- Knowles, T. J., et al. Membrane proteins solubilized intact in lipid containing nanoparticles bounded by styrene maleic acid copolymer. Journal of the American Chemical Society. 131 (22), 7484-7485 (2009).
- Xue, M., Cheng, L., Faustino, I., Guo, W., Marrink, S. J. Molecular Mechanism of Lipid Nanodisk Formation by Styrene-Maleic Acid Copolymers. Biophysical Journal. 115 (3), 494-502 (2018).
- Parmar, M., et al. Using a SMALP platform to determine a sub-nm single particle cryo-EM membrane protein structure. Biochimica and Biophysica Acta Biomembrames. 1860 (2), 378-383 (2018).
- Yu, L., Lu, W., Wei, Y. AcrB trimer stability and efflux activity, insight from mutagenesis studies. PLoS One. 6 (12), 28390 (2011).
- Broussard, J. A., Rappaz, B., Webb, D. J., Brown, C. M. Fluorescence resonance energy transfer microscopy as demonstrated by measuring the activation of the serine/threonine kinase Akt. Nature Protocols. 8 (2), 265-281 (2013).
- Ma, L., Yang, F., Zheng, J. Application of fluorescence resonance energy transfer in protein studies. Journal of Molecular Structure. 1077, 87-100 (2014).
- Sachl, R., Humpolickova, J., Stefl, M., Johansson, L. B., Hof, M. Limitations of electronic energy transfer in the determination of lipid nanodomain sizes. Biophysical Journal. 101 (11), 60-62 (2011).
- Woehler, A., Wlodarczyk, J., Neher, E. Signal/noise analysis of FRET-based sensors. Biophysical Journal. 99 (7), 2344-2354 (2010).
- Wang, Z., et al. Comparison of in vitro and in vivo oligomeric states of a wild type and mutant trimeric inner membrane multidrug transporter. Biochemical and Biophysical Reports. 16, 122-129 (2018).
- Scarff, C. A., Fuller, M. J. G., Thompson, R. F., Iadaza, M. G. Variations on Negative Stain Electron Microscopy Methods: Tools for Tackling Challenging Systems. Journal of Visualized Experiments. (132), e57199 (2018).
- Lu, W., Zhong, M., Wei, Y. Folding of AcrB Subunit Precedes Trimerization. Journal of Molecular Biology. 411 (1), 264-274 (2011).
- Lebon, G. . Structure and Function of GPCRs. , 229-230 (2019).
- Rames, M., Yu, Y., Ren, G. Optimized negative staining: a high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (90), e51087 (2014).
- Lee, S. C., et al. A method for detergent-free isolation of membrane proteins in their local lipid environment. Nature Protocols. 11 (7), 1149-1162 (2016).
- Hall, S. C. L., et al. An acid-compatible co-polymer for the solubilization of membranes and proteins into lipid bilayer-containing nanoparticles. Nanoscale. 10 (22), 10609-10619 (2018).
- Oluwole, A. O., et al. Solubilization of Membrane Proteins into Functional Lipid-Bilayer Nanodiscs Using a Diisobutylene/Maleic Acid Copolymer. Angewandte Chemie International Edition England. 56 (7), 1919-1924 (2017).
